【摘要】目的:探讨观察刺梨黄酮对UUO模型大鼠肾纤维化TGF-β1/Smads信号转导干预作用，并分析其机制。方法：将75只造模成功的肾纤维化大鼠随机分为5组，即假手术组、模型对照组、氯沙坦钾组、刺梨黄酮中剂量及大剂量组，每组各15只。氯沙坦钾组给予氯沙坦钾灌胃；刺梨黄酮中剂量及大剂量组分别给予刺梨黄酮灌胃。模型组和假手术组均同时给予同等容积的生理盐水。干预14d后，观察24hUpro、Scr、BUN，对比各组大鼠肾脏组织TGF-β1、Smad2/3、Smad7蛋白表达水平，分析刺梨黄酮对肾纤维化大鼠作用机制。结果：干预过程中，模型组和氯沙坦钾组各有1只大鼠死亡。模型组、氯沙坦钾组、刺梨黄酮中剂量和大剂量组24hUpro、Scr和BUN水平较假手术组显著升高（P＜0.01）；治疗后氯沙坦钾组、刺梨黄酮中剂量和大剂量组较模型组显著降低；与氯沙坦钾组相比，刺梨黄酮中剂量组24hUpro、Scr和BUN表达水平无明显差异((P﹥0.05)。免疫组化显示模型组、氯沙坦钾组和刺梨黄酮不同剂量组中，各组TGF-β1、Smad2/3表达均明显高于假手术组(P＜0.01)，各治疗组的表达水平明显低于模型组(P＜0.05)。各组Smad7的表达均明显低于假手术组(P＜0.01)，各治疗组的表达水平明显高于模型组(P＜0.05)。与氯沙坦钾组比较，刺梨黄酮中剂量组TGF-β1、Smad2/3、Smad7表达水平无明显差异。结论：刺梨黄酮中剂量组可显著改善肾纤维化大鼠肾功能指标，推测和抑制TGF-β1、Smad2/3蛋白表达、激活Smad7蛋白表达有关。
【关键词】刺梨黄酮；肾纤维化；信号转导；转化生长因子-β1；机制
肾纤维化和肾小球硬化是终末期肾功能衰竭主要病理表现，是肾病科常见症状，预后差且具有较高死亡率。据流行病学研究表明[1]，当前慢性肾脏病发病率已超过10%，且仍呈明显升高趋势。既往相关研究表明[2]，转化生长因子-β1（TGF-β1）在众多促肾间质纤维化因子中发挥重要作用，是发生病理改变的关键环节。Smads蛋白是TGF-β1家族信号中内转导分子，TGF-β1/Smads信号转导是发生肾纤维化的共同通路。近年来临床研究发现，刺梨黄酮不仅具有显著抗氧化作用，还具有广泛生物学活性，能够延缓肾纤维化病情进展[3]。但是目前关于刺梨黄酮对肾纤维化作用机制尚未见系统报道。我们以UUO模型大鼠为研究对象，观察分析刺梨黄酮对其干预作用和机制，旨在为肾纤维化临床治疗提供全新思路。
1 资料与方法
1.1 一般资料 SD健康雄性大鼠100只，体重为140-160g，均由上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供，于上海中医药大学肾病研究所饲养。所有大鼠纳入实验研究后均先给予为期1周的适应性喂养。
1.2 方法
1.2.1 主要试剂和仪器 ①试剂：刺梨冻干粉（购自国药集团金刺梨（贵州）科技开发有限公司）；氯沙坦钾组钾（杭州默沙东制药有限公司，批号：L037309）；鼠抗人TGF-β1、Smad2/3、Smad7单克隆抗体（一抗，购自北京中山金桥生物技术有限公司）及兔抗鼠TGF-β1、Smad2/3、Smad7单克隆抗体（二抗，购自北京中山金桥生物技术有限公司）。
1.2.2 造模和分组方法 75只大鼠建立单侧输尿管梗阻（Unilateral ureteral obstruction,UUO）肾间质纤维化经典实验模型，方法参照文献[4]，将75只造模成功的大鼠采用随机数字表法分为5组，即假手术组（S）、模型对照组(M)、氯沙坦钾组(L)、刺梨黄酮中剂量(CZ)及大剂量组(CD)，每组各15只。
1.2.3 干预方法 所有大鼠干预剂量均参照马氏定理设定。氯沙坦钾组给予氯沙坦钾组灌胃，剂量为10mg/（kg·d）-1，浓度为20%；刺梨黄酮中剂量及大剂量组分别给予剂量为3g/（kg·d）-1和6g/（kg·d）-1，浓度分别为3%和6%。模型组和假手术组均同时给予同等容积无菌生理盐水灌胃。所有实验大鼠均每天干预1次，连续干预14d。
1.2.4 肾功能相关指标测定 所有大鼠均于干预结束后采用免疫比浊法定量检测24h尿蛋白（24hUpro）；次日空腹抽取尾静脉血3ml，分别采用二乙酰一肟法和肌氨酸氧化酶法定量检测血尿素氮（BUN）和血肌酐（Scr）。
1.2.5 TGF-β1、Smad2/3、Smad7蛋白表达检测方法 取血后采用脊椎脱臼法处死，取左侧肾组织，以4%的多聚甲醛固定处理后，利用免疫组化法检测肾脏组织中TGF-β1、Smad2/3、Smad7蛋白表达水平。利用Image-Pro Plus计算机软件检测各组TGF-β1、Smad2/3、Smad7蛋白免疫组化相对含量。
1.3 观察指标 ①观察各组大鼠肾功能相关指标变化；②对比各组大鼠TGF-β1、Smad2/3、Smad7蛋白免疫组化相对含量。
1.4 统计学分析 采用SPSS 18.0计算机软件对所得数据进行分析，所有数据均以（`x ±s）表示，计量组间差异采用单因素方差分析，组间两两比较用LSD检验，P＜0.05 视为有统计学差异。
2.讨论
肾纤维化几乎是所有慢性肾脏病无法避免的临床结局，和慢性肾功能损伤严重程度均存在明显正向相关性。既往大量相关研究表明，肾小管上皮细胞转分化，进而诱发肌成纤维细胞的形成是肾小管发生病理改变、肾纤维化形成的主要机制[5]。此外，还有部分细胞因子和细胞信号通路表达、转导异常也对该病的发生和发展起重要推动作用，尤以TGF-β1通过自分泌和旁分泌等不同途径导致肾小管上皮细胞增殖，并随着病情逐渐严重导致细胞外基质积聚，也是肾纤维化形成的重要机制[6]。
几乎人体所有的正常组织细胞表面均有TGF-β受体，正常情况下其蛋白表达水平较低，但是在高糖、高血栓素A2、氧化压力及低密度脂蛋白作用和刺激下，将导致TGF-β激活并呈现出异常高表达状态，从而使得其生物学活性和功能造成紊乱[7]。据报道[8]，TGF-β1对肾小管和肾小球上皮细胞均具有促进和抑制细胞有丝分裂和增殖双重作用，且对细胞外基质的合成和沉积也有较为强烈的刺激作用，其具体作用机制如下：①增加细胞外基质蛋白质的合成；②减少细胞外基质的降解；③增强细胞表面受体-整合素表达水平，促进细胞外基质沉积。此外，TGF-β1还具有明显自我诱生作用，微生物学作用在损伤的肾脏组织局部明显被放大。
在肾纤维化形成和发展过程中，Smads蛋白作为TGF-β受体下游的一项重要信号转导因子，广泛表达于整个机体发育过程[9]。Smad2/3和Smad7均是其中发挥重要生物学作用的成员，其中前者可同TGF-β1协同作用增强肾小管和肾小球上皮细胞的损伤作用，后者可与活化的TGF-β受体相结合，进一步阻断R-Smads的磷酸化进程，从而对其自身家族信号转导产生重要负调控作用[10-11]。TGF-β1/Smads信号转导通路是后者蛋白家族介导的具有独特信号特征的通路，在慢性肾病、恶性肿瘤和自身免疫性疾病发生中均起到重要作用[12-13]。故而在肾纤维化治疗中，应当考虑调节TGF-β1/Smads信号转导通路，通过调控相关蛋白表达水平延缓病情进展。
祖国医学中认为肾纤维化属于“溺毒”、“关格”和“虚劳”范畴。正气虚衰、邪实内留，终致脾肾衰败、湿浊内留。治以补肾益气、去浊除湿[14]。刺梨作为药食两用植物，具有较高的药用价值，既可清热解毒，又可养阴益气，补肾健脾。现代药理证实，刺梨中含有丰富的刺梨黄酮，不仅可以延缓衰老，还可增强机体抵抗力、发挥抗炎、抗癌作用，且在肾纤维化患者中应用还可增强肾小管和肾小球上皮细胞的自我修复功能[15]。临床研究发现刺梨黄酮可以显著改善上述因子水平[16]，提示刺梨黄酮对肾纤维化具有治疗作用。
本研究结果显示，刺梨黄酮中剂量组24hUPRO、BUN和Scr水平改善程度接近氯沙坦钾组而优于刺梨黄酮大剂量组，且前者TGF-β1、Smad2/3蛋白免疫组化相对含量低于后者，Smad7高于后者，提示中剂量刺梨黄酮对肾纤维化大鼠具有肾功能改善作用，其作用机制很可能和抑制TGF-β1、Smad2/3蛋白表达，激活Smad7蛋白表达有关。
贵州苗药刺梨属纯天然植物，药源广，口感好，作为药食两用植物较之氯沙坦钾组毒副作用小，安全性高，并且对TGF-β1/Smads信号转导过程具有有效积极干预作用，在治疗肾纤维化方面具有独特优势，在保健品及药品开发中有较广阔的市场前景。
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