【摘要】目的探讨骨髓来源间充质干细胞(MSCs)移植对大鼠肺气肿的疗效及其可能机制｡方法24只雌性sD大鼠按随机数字表法随机分为对照组､肺气肿组､MSCs移植组各8只,将肺气肿组与MSCs移植组大鼠烟雾暴露14周,制作肺气肿大鼠模型,予MSCs移植组大鼠通过尾静脉注6一二乙酰基-2一苯基吲哚(DAPI)标记的骨髓来源MSCs｡MSCs移植后第14､28天检测MSCs植入及转分化情况｡MSCs移植8周,观察大鼠肺组织病理形态,并进行定量分析;检测凋亡细胞;测定血清和肺组织匀浆中氧化应激水平｡结果MSCs移植后第14､28天,受体肺组织内可见到DAPI标记的MSCs,其中一部分外源性MSCs表达表面活性蛋白C,即一部分植入肺部的MSCs分化成肺泡Ⅱ型上皮细胞｡肺气肿组､MSCs移植组肺组织平均内衬间隔均著高于对照组[(111±23)､(90±15)比(74±10)仙m,平均肺泡数均显著低于对照组[(94±22)､(125±15)比(159±22个/mm2](均P<0.05);肺气肿组肺组织平均内衬间隔显著高于MSCs移植组,而平均肺泡数显著低于MSCs移植组(均P<0.05)｡肺气肿组肺泡壁细胞凋亡指数显著高于MSCs移植[(13.5±2.5)%比(4.8±0.7)%,P<0.05]｡肺气肿组､MSCs移植组血清和肺组织中丙二醇均显著高于对照组[(4.3 4-0.8)､(3.7 4-0.4)比(3.0±0.4)nmol/ml(5.44-0.5)(4.84-0.4)(4.24-0.6)nmoL/mg,均P<0.05];肺气肿组血清和肺组织中丙二醇均显著高于MSCs移植组(均P<0.05)｡肺气肿组､MSCs移植组血清和肺组织中超氧化物歧化酶均显著低于对照组[(8.7 4-0.8)､(9.6 4-0.7)比(10.5 4-0.9)U/ml和(56.3 4-13.4)､(70.2 4-11.0)比(84.9 4-13.0)U/mg,均P<0.05];肺气肿组血清和肺组织中超氧化物歧化酶均显著低于MSCs移植组(均P<0.05)｡结论骨髓来源MSCs移植可减轻吸烟所致的大鼠肺气肿,其可能机制是MSCs归巢､植入至受损伤的肺组织并分化为肺泡Ⅱ型上皮细胞,MSCs还可能通过抑制细胞凋亡､抑制氧化应激对肺气肿发挥治疗作用｡
【关键词】肺气肿; 间质干细胞移植;治疗效果;大鼠
    肺气肿是慢性阻塞性肺疾病(慢阻肺)非常关键的病理改变,以肺泡壁缺失及终末细支气管远端的空腔永久性扩大为特征J｡肺气肿的形成是一个不可逆的病理过程｡吸烟是导致肺气肿的关键因素,慢性炎症､蛋白酶/抗蛋白酶失衡､细胞凋亡及氧化应激参与吸烟导致肺气肿的发病过程｡肺气肿的治疗首先是戒烟,但戒烟以后炎症反应､氧化应激及细胞凋亡等仍然持续存在｡肺气肿发病机制复杂,依靠机体的自我再生能力无法达到完全的修复,且目前的内科治疗不能逆转肺气肿,因此迫切需要寻找一种新的可能有效治疗肺气肿的方法｡于细胞研究领域的研究进展为间充质于细胞(MSCs)治疗肺部疾病带来了新的希望｡干细胞是未分化的细胞,它可以从骨髓或其他器官动员到损伤组织,分化成不同的细胞表型,以发挥修复功能｡MSCs似乎还能调节炎症及氧化应激｡动物实验表明,MSCs移植对多种呼吸系疾病有治疗作用[z-5 3,但关于MSCs治疗肺气肿的效果及机制不完全清楚｡本研究建立肺气肿大鼠模型,进一步探讨MSCs对肺气肿的治疗作用及其可能机制｡
材料与方法
一､实验动物及材料
1.动物:6周龄SPF级健康雌性sD大鼠24只,体质量140160 g(昆明医科大学实验动物中心提供)｡
2.主要仪器材料:抗鼠CD45 FITC､抗鼠CD90.1 FITC､抗鼠CD44H PE及FITC､FE同型对照(美国eBioscience公司),抗鼠CD34 FITC､兔抗大鼠表面活性蛋白C(SP.C)抗体(美国Santa Cruz公司);4,6一二乙酰基-2一苯基吲哚(DAPI,北京中杉金桥生物技术限公司);成骨诱导､成脂诱导试剂盒(美国Cyagen公司);CY3.山羊抗兔抗体(武汉谷歌生物科技有限公司);原位细胞凋亡检测试剂盒(美国Roche公司);丙二醇､超氧化物歧化酶试剂盒(南京建成生物研究所)｡
二､方法
1.动物分组:24只大鼠用随机数字表法随机分为对照组､肺气肿组､MSCs移植组各8只｡
2.建立动物模型:肺气肿组及MSCs移植组均利用烟熏的方法诱导肺气肿,之后MSCs移植组予MSCs移植｡大鼠肺气肿模型的制作参照文献[6],稍有改变,每次熏烟15支,每次约45 min,2次/d,每周5 d,持续14周｡对照组大鼠在常氧下饲养14周｡
3.MSCs的分离､培养､扩增及鉴定:MSCs的分离､培养和扩增方法同文献[2]｡取第3代MSCs用流式细胞仪检测细胞表面抗原CD34､CD45､CD44及CD90的表达,进行细胞表型鉴定｡取第3代MSCs通过诱导成骨､成脂进行功能鉴定｡
4.MSCs的标记与肺气肿大鼠MSCs移植:于移植当天,将第3代大鼠MSCs用DAPI标记后,稀释至1 X 10 7/ml,冰浴｡1 h内将细胞通过尾静脉注人受体大鼠体内,细胞数约5×106/只,1次/周,连续4次｡对照组及肺气肿组输注等体积PBS｡
5.观察MSCs的植入及转分化情况:在完成4次MSCs移植后第14､28天分别处死MSCs移植组大鼠各1只,取新鲜肺､心､肝､胰､脾､肾行冰冻切片,荧光显微镜下观察DAPI标记细胞(即MSCs)植入､分布情况｡并将肺组织冰冻切片,以兔抗大鼠SP—C抗体(1:1 000稀释)作一抗,CY3.山羊抗兔抗体(1:300稀释)作为荧光二抗行免疫荧光检测｡荧光显微镜下观察并采集图像｡
6.血清和肺组织的留取:完成MSCs移植8周后戊巴比妥钠(5 mg/kg)腹腔内注射麻醉,同期处死剩余所有大鼠｡腹主动脉部穿刺采血､离心后保存于一70℃冰箱备用｡分离肺脏,右肺放一70℃冰箱保存备用｡4%多聚甲醛固定左肺后作常规石蜡包埋､切片｡
7.大鼠肺组织病理切片形态定量分析:每只大鼠取左肺最大横径处肺组织,常规石蜡切片,行HE染色作常规病理学检查｡每例标本选2张切片,每切片取5个视野(避开大血管和支气管),在100倍光学显微镜下观察:在每个视野正中心划十字交叉线,计算与交叉线相交的肺泡隔数和每个视野内肺泡数,同时测出十字线总长和每个视野面积,按公式平均内衬间隔=十字线总长/肺泡隔数,其数值反映肺泡平均直径｡按公式平均肺泡数=每个视野内肺泡数/每个视野面积,其数值反映肺泡的密度｡
8.肺泡壁细胞凋亡检测:石蜡切片按原位细胞凋亡检测试剂盒说明操作,检测肺泡壁凋亡细胞｡定量分析:每只大鼠观察2张切片,每张切片10个高倍视野(×400)中凋亡阳性细胞数占总细胞数的百分比即凋亡指数｡
9.肺组织匀浆与血清中超氧化物歧化酶和丙二醇水平测定:制备肺组织匀浆,按照丙二醇､超氧化物歧化酶试剂盒说明书操作,测定血清和肺组织匀浆中丙二醇及超氧化物歧化酶的水｡
三､统计学方法
    应用SPSS 17.0软件进行统计学分析｡正态分布的计量资料用元±s表示,两组独立样本均数的比较采用t检验;多组资料的均数比较采用One—WayANOVA分析,两两比较采用LSD-t检验｡以P<0.05为差异有统计学意义｡
结果
1.MSCs表型､功能鉴定结果:流式细胞仪检测显示,第3代MSCs高表达CDdg(97.2%)CD90(97.7%)等MSCs相对特异性抗原,而不表达造血细胞标志抗原CD34(0.4%)及CD45(0.5%)｡证实本实验培养的细胞为MSCs｡
2.MSCs功能鉴定结果:成骨诱导3周后细胞呈堆积生长,茜素红s染色可见矿化结节;成脂诱导显示,随着诱导时间的延长,脂滴逐渐增多､融合,油红0染色显示红色脂滴(图1)｡
3.MSCs在肺组织的植入及分化情况:DAPI标记后的MSCs带蓝色荧光｡MSCs移植后的第14､28天,MSCs移植组肺组织内可见到带蓝色荧光的细胞(即MSCs),并随时间的推移而减少(图2)｡心､肝､胰､脾､肾等组织均无MSCs分布｡SP.C免疫荧光检测发现一部分同时带蓝色荧光与红色荧光(即sP.C阳性)的细胞(图3)｡
4.肺组织病理学观察结果:对照组肺组织肺泡大小均匀,肺泡数目较多｡肺气肿组和MSCs移植组肺组织呈现肺气肿样改变,肺泡大小不一,肺泡数目减少,肺泡腔扩大,肺泡间隔不同程度地断裂｡MSCs移植组肺气肿样改变较肺气肿组减轻(图4)｡定量分析显示,肺气肿组和MSCs移植组平均内衬间隔均显著高于对照组,平均肺泡数均显著低于对照组,肺气肿组平均内衬间隔显著高于MSCs移植组,平均肺泡数显著低于MSCs移植组(均P<0.05)(表1)｡
5.肺泡壁细胞凋亡检测结果:荧光显微镜下凋亡的细胞带绿色荧光｡对照组肺泡壁未见细胞凋亡,肺气肿组肺泡壁细胞凋亡较MSCs移植组明显(图5)｡定量分析显示:肺气肿组肺泡壁细胞凋亡指数显著高于MSCs移植组[(13.5±2.5)%比(4.8±0.7)%,P<0.05]｡
6.超氧化物歧化酶和丙二醇的水平:肺气肿组和MSCs移植组血清及肺组织中丙二醇的水平均显著高于对照组,超氧化物歧化酶的水平均显著低于对照组;肺气肿组血清及肺组织中丙二醇的水平均显著高于MSCs移植组,超氧化物歧化酶的水平均显著低于MSCs移植(P<0.05)(表2)｡
讨论
    本研究结果显示,对照组大鼠实验过程中无明显的呼吸道症状,肺气肿组与MSCs移植组大鼠逐渐出现呼吸急促及喷嚏样症状｡肺气肿组和MSCs移植组大鼠的肺组织呈肺气肿样改变,肺气肿组较明显,表明MSCs移植可以减轻大鼠肺气肿｡MSCs是未分化､具有多分化潜能的细胞,在组织修复过程中发挥重要作用｡本研究显示,MSCs可植人肺部,并分化为肺泡Ⅱ型上皮细胞,这可能是MSCs治疗肺气肿的机制之一｡肺气肿大鼠模型证明MSCs可分化为肺泡Ⅱ型上皮细胞及肺泡上皮细胞｡MSCs移植后的存活率及植入率低,故疗效受影响｡细胞凋亡参与肺气肿的发病过程｡本研究结果显示,MSCs移植组肺泡壁细胞凋亡指数较肺气肿组降低,抑制细胞凋亡可能是MSCs治疗肺气肿的机制之一｡刘红梅等3 14在木瓜蛋白酶和60 Co照射所致肺气肿大鼠中发现,MSCs可降低肺泡壁细胞的凋亡,MSCs可能通过上调血管内皮生长因子及其受体水平和下调半胱天冬酶-3的水平抑制肺泡壁细胞凋亡｡氧化应激在肺气肿的发病过程中起枢纽作用｡本研究发现,肺气肿组和MSCs移植组氧化应激水平高于对照组,MSCs移植组氧化应激水平低于肺气肿组｡故减轻氧化应激可能是MSCs治疗肺气肿的另一机制｡既往研究表明,在脂多糖诱导的肺损伤模型【1副及自发性中风模型6中,MSCs移植可降低氧化应激水平｡目前仅有的一项MSCs移植治疗慢阻肺的随机､双盲､对照临床研究结果表明,MSCs移植组患者,急性加重次数､生活质量､肺功能指标等较对照组无差别,但C反应蛋白的水平较对照组显著下降;随访2年内,无致瘤､毒副作用发生｡ 

    综上所述,骨髓来源MSCs移植可有效减轻吸烟所致的大鼠肺气肿,其可能机制是:首先,MSCs归巢､植入至受损伤的肺组织并分化为肺泡Ⅱ型上皮细胞;其次,MSCs移植可能通过抑制细胞凋亡､降低氧化应激水平发挥治疗作用｡目前临床应用只是一个初步的探索和尝试,还存在一些问题有待解决,包括:MSCs移植方案需完善,临床疗效及其安全性需进行大宗病例长期系统观察,需探索提高MSCs存活率及植入率方法｡但其作为一种治疗肺气肿全新方式仍有很大的发展空间｡
    本研究的缺陷及改进方向:以肺组织学变化作为观察疗效的主要指标,缺乏其他功能性指标;DAPI标记MSCs体内示踪存在假阳性以及观察周期较短问题,应尝试用Y染色体原位杂交方法追踪MSCs的定位情况;检测MSCs植入及转分化的时间截点与观察肺组织学变化､检测血生化及凋亡的时间截点不一致,建立在此基础上得到相关结论不够充分和令人信服｡将来的研究应加密时间点,对MSCs在体内的分布及转分化情况作动态观察｡志谢成都军区昆明总医院临床实验科王金祥和王强在MSCs的培养､鉴定､输注及分子生物学检测过程中提供技术指导;成都军区昆明总医院临床实验科刘菊芬､沈丽蓉为动物模型的建立提供帮助。
参考文献
[4]尚峰,何志旭,汪浩文,等.血管内皮生长因子基因转染的骨髓间充质干细胞移植对大鼠肺动脉高压的治疗作用[J].中华医学杂志,201l,91(26):1847-185l.
[8]顾超,严建平,许武林,等.大鼠羊水间充质干细胞向Ⅱ型肺泡上皮细胞定向分化的体外实验[J].中华医学杂志,2014,94(26):2050-2054.
[9]甄国华,刘红梅,张珍祥,等.骨髓间充质干细胞移植对木瓜蛋白酶和”co照射所致大鼠肺气肿的作用[J].中国病理生理杂志,2008,24(8):1529—1533.
[10]方翔,汤兵祥,张曼林,等.骨髓间充质干细胞移植对肺气肿大鼠的影响[J]郑州大学学报(医学版),2010,45(3):395—398.
[13]刘红梅,马利军,张罗献,等.间充质干细胞移植减轻大鼠肺气肿和肺泡壁细胞凋亡机制探讨[J].华中科技大学学报(医学版),2010,39(5):610613.
[14]刘红梅,马利军,牛红丽,等.骨髓间充质干细胞移植对肺气肿大鼠氧化应激与细胞凋亡的影响[J].中华结核和呼吸杂志,2011,34(9):697698.