摘要 目的:从瑶药葫芦钻中筛选出具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的有效部位｡方法:将葫芦钻水提物依次用石油醚､乙酸乙酯､正丁醇萃取得到不同极性部位,分别测定各部位对α-葡萄糖苷酶的抑制活性,并对筛选出的活性强且得率相对较高的部位进行酶抑制动力学研究;考察各部位对葡萄糖､蔗糖和淀粉负荷小鼠血糖值的影响(以阿卡波糖片为阳性对照)｡结果:体外酶活性抑制试验显示,葫芦钻乙酸乙酯部位[得率为0.40%､酶活性抑制率为(72.90±2.85)%]具有较强的α-葡萄糖苷酶抑制活性,且呈现出剂量依赖的快速非竞争性可逆抑制类型｡体内耐糖量实验结果表明,阿卡波糖片和葫芦钻各部位对葡萄糖负荷小鼠的血糖值均没有影响(P>0.05),而阿卡波糖片和葫芦钻乙酸乙酯部位能降低蔗糖负荷小鼠30､60min的血糖值以及淀粉负荷小鼠30､60､120min的血糖值(P<0.05或P<0.01)｡结论:乙酸乙酯部位是瑶药葫芦钻中α-葡萄糖苷酶抑制活性的有效部位｡
关键词 瑶药;葫芦钻;α-葡萄糖苷酶抑制剂;不同极性部位;小鼠;耐糖量实验
    α-葡萄糖苷酶(α-glucosidase)是一类酶的总称,其能从含有α-糖苷键的底物中催化水解α-葡萄糖基,主要存在于小肠刷状缘膜上皮细胞中,能够将双糖或多糖水解为可以被小肠吸收的单糖,是食物中碳水化合物水解的关键酶｡因此,抑制该酶可以有效地减少食物中碳水化合物的吸收,一定程度改善餐后高血糖的症状[1]｡
    葫芦钻为天南星科石柑属石柑子[Pothoschinensis(Raf.)Merr.]的全草,系传统瑶药“十八钻”之一,又名上树葫芦､石葫芦茶､藤桔､柚子枫､石蒲藤等,主要分布于广东､广西､贵州､四川､云南等地[2]｡其味淡､涩,性凉,在瑶医用药中属“风打相兼”类,具清热解毒､凉血止血､利尿消肌等功效,是我国南方瑶､壮等少数民族常用的药材之一[3-4]｡有关葫芦钻化学成分的研究表明,其含有酚酸等有机酸类[5-7]､黄酮碳苷类[8]､挥发油[9]､蒽醌､香豆素､萜类等化合物[10-11]｡现代药理研究表明,其具有抗肿瘤[12]､抗氧化[13-14]､降血糖[15]等作用,然而尚缺乏对其更深入的作用机制及相关物质基础的研究｡鉴于此,本研究结合体外酶抑制活性试验与体内糖耐量实验从葫芦钻中筛选出具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的有效部位,为进一步从中提取分离α-葡萄糖苷酶抑制剂提供参考｡
1材料
1.1仪器
    UV-1750型紫外-可见分光光度计(日本岛津仪器有限公司);PHS-2C型pH计(上海三信仪表厂);电子天平(上海梅特勒公司)｡
1.2药材､药品与试剂
    葫芦钻购于桂林市六合路中草药市场,由桂林医学院张可锋讲师鉴定为天南星科石柑属石柑子[Pothoschinensis(Raf.)Merr.]的全草;阿卡波糖片(拜耳医药保健有限公司,批号:BJ14499,规格:50mg/片);α-葡萄糖苷酶(10U/mg)､4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)购自美国Sigma公司;葡萄糖测试试剂盒(中生北控生物科技股份有限公司,批号:143291);其余试剂均为分析纯｡
1.3动物
    SPF级健康KM小鼠,♂,体质量为(20±2)g,由兰州大学动物实验中心提供,实验动物合格证号:SCXK(甘)2009-0004｡
2方法
2.1葫芦钻各部位的提取与分离
    取干燥葫芦钻2kg,切碎,按药材与蒸馏水1∶10(m/V)的比例加热回流提取7次,每次1.5h,合并提取液,抽滤,减压浓缩至2L｡取100mL浓缩液真空干燥,其余浓缩液依次用石油醚､乙酸乙酯､正丁醇萃取,回收溶剂,低温真空干燥得石油醚､乙酸乙酯､正丁醇和剩余水部位(依次简称为PF､EAF､nBF､WF),称质量､计算得率｡
2.2葫芦钻各部位对α-葡萄糖苷酶抑制活性的测定
    以PNPG为底物,利用α-葡萄糖苷酶催化水解PNPG产生对硝基酚(PNP),以一定时间内反应体系中PNP的含量变化来计算样品提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制活性｡具体按如下反应体系[16]进行:取0.1mol/L的磷酸盐缓冲液2mL,加入待测样品提取物100µL与PNPG(终浓度为2mmol/L),然后加入α-葡萄糖苷酶0.05U,37℃反应15min后,加入0.1mol/L碳酸钠(Na2CO3)溶液4mL终止反应｡在397nm波长处测定吸光度(A)值,计算酶活性抑制率{[A0-(A1-A2)]/A0×100%,A0:空白,即不加样品反应后的A值;A1:加入样品反应后的A值;A2:背景,即只加样品的A值}｡
2.3EAF的酶抑制动力学试验
    在EAF质量浓度分别为0.01､0.05､0.1､0.5､1､2､5mg/mL时,测定其酶抑制活性,考察EAF不同质量浓度对酶活性的影响;在EAF质量浓度为5mg/mL的条件下,分别测定反应时间为1､3､5､10､15､20min的酶抑制活性,考察EAF不同反应时间对酶活性的影响;在酶浓度为0.24､0.36､0.48､0.60U/mL时测定EAF质量浓度分别为0､5mg/mL时的酶抑制活性,考察其抑制作用的可逆性;取0.5､1､1.7､2mmol/L4个浓度的PNPG与1､2､5mg/mL3个质量浓度的EAF,分别测定反应速率,由LineweaverBurk作图法绘制EAF的酶抑制动力学曲线,考察其抑制作用类型｡
2.4葫芦钻各部位对小鼠耐糖量的影响实验
    将小鼠适应性喂养3d后,按照体质量大小编号,依据随机数字表将其分成16组,每组10只,分别为1个正常组､3个阿卡波糖片组(25mg/kg)､3个生理盐水组､3个葫芦钻EAF组(75mg/kg)､3个葫芦钻nBF组(75mg/kg)和3个葫芦钻WF组(75mg/kg),分别进行葡萄糖､蔗糖和淀粉耐糖量实验｡试验前禁食12h,然后ig受试药物(10mL/kg)与葡萄糖(2g/kg)或蔗糖(4g/kg)或淀粉(6g/kg)｡分别在给药后30､60､120min时经眼眶静脉采血,按试剂盒说明书方法测定血糖值｡
2.5统计学方法
    采用SPSS17.0统计学软件进行统计学分析｡数据以x±s表示,采用方差分析和t检验进行组间比较｡P<0.05表示差异有统计学意义｡
3结果
3.1葫芦钻各部位的得率与酶活性抑制率测定结果
    葫芦钻各部位的得率与酶活性抑制率测定结果见表1｡
表1葫芦钻各部位的得率与酶活性抑制率测定结果(n=3,%)
    由表1可知,葫芦钻各部位中WF的得率最大,PF的得率最小,分别占总提物的80%和1%;葫芦钻EAF和nBF的得率分别为0.40%和0.67%,分别占总提物的7%和12%,可见葫芦钻中主要含强极性成分｡但对α-葡萄糖苷酶的抑制活性则是随着极性渐大而渐小,即WF的酶抑制活性最弱,而弱极性的PF和EAF则活性最强｡此外,由于PF的活性虽然最强,但得率太低,故选择EAF作为后续酶抑制动力学试验的研究对象｡
3.2EAF的酶抑制动力学试验结果
    EAF的酶抑制动力学试验结果详见图1｡
图1EAF的酶抑制动力学试验结果
    由图1A可知,EAF的酶活性抑制率随EAF质量浓度的增加逐渐增大,且呈浓度依赖关系,半数抑制浓度(IC50)为0.74mg/mL｡由图1B可知,当EAF的质量浓度为5mg/mL时,可快速抑制酶活性,且在1min内酶活性抑制率就可以达到最大值,之后稍呈下降趋势｡由图1C可知,EAF对酶抑制类型属可逆性抑制｡由图1D可知,EAF对酶的抑制呈非竞争性抑制类型,米氏常数Km=1.43mmol/L｡
3.3葫芦钻各部位对小鼠耐糖量的影响测定结果
    葫芦钻各部位对小鼠耐糖量的影响测定结果见表2｡
表2各组小鼠耐糖量实验测定结果(x±±s,n=10)
    由表2可知,在葡萄糖耐糖量实验中,阿卡波糖片和葫芦钻各部位对葡萄糖负荷小鼠的血糖值均没有影响(P>0.05);而在蔗糖耐糖量实验中,阿卡波糖片和EAF均能够降低蔗糖负荷小鼠30､60min时的血糖值(P<0.05或P<0.01);同样在淀粉耐糖量实验中,阿卡波糖片和EAF也能够降低淀粉负荷小鼠30､60､120min时的血糖值(P<0.05或P<0.01)｡本研究结果与体外酶活性抑制试验筛选结果相一致,葫芦钻各部位中EAF在耐糖量实验中的活性也最强,同时也可初步判断其是通过抑制肠道内的α-葡萄糖苷酶活性来发挥降血糖作用｡
4讨论
    α-葡萄糖苷酶抑制剂能够有效地降低餐后高血糖,可用于糖尿病及其并发症的防治｡因此,自从第一个α-葡萄糖苷酶抑制剂类降糖药——阿卡波糖片上市后,国内外研究者开始从天然产物中筛选更安全､有效的α葡萄糖苷酶抑制剂,包括黄酮类､生物碱类､多糖类和多酚类等化合物[17]｡本研究结合体外α-葡萄糖苷酶抑制活性试验与体内耐糖量实验对葫芦钻中具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的成分进行了筛选,体内外结果一致表明其活性成分主要存在于EAF,且EAF对酶的抑制呈非竞争性抑制类型｡
    由于葡萄糖是单糖,可直接在胃肠道内吸收,所以不受α-葡萄糖苷酶抑制剂的影响;而作为双糖的蔗糖和多糖的淀粉,二者必须由α-葡萄糖苷酶水解转化为葡萄糖才能被吸收｡因此,在耐糖量实验中,阳性药物阿卡波糖片和葫芦钻EAF对葡萄糖耐糖量实验中小鼠的血糖值均没有影响,而对蔗糖和淀粉耐糖量实验中小鼠的血糖值具有显著的降低作用,这也说明葫芦钻EAF和阿卡波糖片的体内降血糖作用机制相似｡
    此外,覃振林等[15]采用四氧嘧啶致糖尿病小鼠模型和葡萄糖致高血糖小鼠模型研究了葫芦钻不同提取物的降血糖活性,结果水提醇沉(95%乙醇)后的上清液和沉淀物均可明显降低两种模型小鼠的血糖值,而70%乙醇提取物却无此作用｡可见,葫芦钻中既存在弱极性的具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的降血糖成分,还存在强极性的具有其他作用机制的活性成分,对其降血糖机制还需更加深入的研究｡
参考文献
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