辅助生殖技术手段辅助不孕夫妇怀孕。目前，临床应用的辅助生殖技术包括人工授精(ARTificialinsemination、AI)和体外受精-胚胎移植以及在传统体外受精技术的基础上发展起来的卵胞浆内单精子注射。精子在体外环境中的处理会承受许多不良刺激，生理、生化和功能都会发生变化。如何减少体外处理过程中对精子的不良刺激，保证处理后回收大量形态和功能正常的精子，是体外精液处理过程中需要注意的问题。本文简要介绍了常用的体外精液处理方法，并探讨了精液处理过程中需要注意的问题。

1精液处理方法。

精液处理过程包括精液液化和精子优化。

1.1精液液化。

新鲜精液呈厚凝固状，精液液化约5~25min，如30min仍不液化称为精液不液化[1]，提示精液成分异常，常由于前列腺液与精液比例紊乱或成分变化引起，精液异常是精子不良生活环境，排出精液后应尽快促进精液液化，然后使精子与精液分离。促进精液液化的常用方法是在每毫升精液中加入侵蚀蛋白酶4000IU，或通过18或19针反复推出精液[2]。如果效果不好，用培养液和精液1：1稀释，用吸管反复吹，直至液化。

1.2精子优选处理方法。

上游法(swim-up)

它是一种常用的精液处理技术，主要用于精液质量好、相对正常的精液。利用活性精子的游动能力，可以游过液体界面进入不同的培养液，从而与死精子、精子、白细胞和杂质分离。根据上游前是否有离心操作，可分为直接上游法和离心上游法。

直接上游法:将含有10%血替代品(SPS、SageBiopharma)的拟人输卵管液(mHTF)2ml加入圆底试管，在试管底慢慢加入液化精液1ml。当精液量较大时，可以多使用几根试管，使两层之间形成界面，将试管倾斜45°，放置在37℃，5%CO2培养箱内孵化40~60min，取出试管，吸出上清液中上层的云状液体，移入离心管。

离心上游法：即改进上游法，将液化精液与新鲜培养液1:1混合，移入离心管，离心200g×5min，放弃清液，按上述方法上游沉淀。

上游法是目前推荐的方法，因为在整个处理过程中，除了培养液，不含其他化学物质[4]。缺点是运动精子回收率低，取决于精子细胞团的表面积和精子活性。由于细胞团有多层细胞，具有潜在运动能力的精子可能位于细胞团内部，无法达到与培养基接触的界面。为了提高回收率，可以使用少量的多管直接上游，以增加精液和培养基的总界面。Al-Hasani等。[4]建议采用每管精液和培养基（1:1~3）总量1ml的微型上游技术（mini-swim-up），仔细移除75%~80%的上层培养基，在不增加精子DNA损伤的情况下增加正常活动精子的数量，优先处理严重的弱畸精子和ICSI。

1.2梯度离心法

适用于大多数精液样本，对粘度高、抗精子抗体清晰的精液样本特别有效，该方法能有效去除碎片和白细胞[5]。分为连续梯度离心法和不连续梯度离心法。

连续梯度离心法:将90%密度梯度液1ml放在离心管底部，然后在其上加入1.5~2ml液化精液。注意保持两个界面清晰。当精液量大于2ml时，可以使用更多的离心管。离心300g×15min，当精液粘度高或精子密度低时，离心时间可适当延长10~20min。去除离心管上部的精浆和密度梯度液，仔细收集底部的精子沉淀物，在离心管中加入3~5ml培养液，重新混合悬挂精子，放弃200g×6min，根据需要调整授精液体积，重新混合悬挂培养箱备用。不连续梯度离心法:将2ml80%密度梯度液加入离心管底部，沿管壁慢慢加入2ml40%密度梯度液，保持两液之间有清晰的界面。在两液上慢慢加入液化精液1.5ml，保持与40%密度梯度液的界面清晰。离心300g×15min，当精液粘度较高或精子密度较低时，离心时间可适当延长10~20min。去除离心管上部的精浆和密度梯度液，仔细收集底部的精子沉淀物，移入新的离心管，加入10ml培养液，重新混合悬浮精子，离心200g×6min，根据需要调整授精液体积，重新混合悬浮精子沉淀物，放入培养箱备用。

与直接采集的精子[6]和上游法处理的标本[7]相比，密度梯度法处理的精子比例显著降低。Sakkas等[8]报告称，密度梯度离心法可以分离DNA断裂和染色体浓度差的精子。Erel等[9]认为，密度梯度离心法处理后，异常精子得到精子的顶体反应率，低渗肿胀试验的阳性率和核成熟精子的比例优于上游法。

1.3玻璃纤维过滤法。

玻璃纤维具有过滤作用。当精液以一定的速度通过时，可以去除精液中不活跃的精子、其他细胞和杂质，特别是粘高的标本，可以去除大量的精子凝集，提高精子的活性。该方法是将一定数量的玻璃纤维填充到长约12厘米的聚合物吸管中，用培养液反复冲洗过滤，直到过滤液中没有玻璃纤维碎片。将聚合物吸管垂直固定在试管架上，将液化精液加入玻璃纤维柱顶部，用无菌玻璃容器收集过滤精液。虽然收集的精液中损失了相当多的精子，但过滤的标本几乎保留了所有的活性精子，可以显著提高活性精子和功能性细胞膜精子的百分比，对精子质量差的精液分离效果更好，可以去除约90%的白细胞。此外，该方法还显著提高了精子染色体的完整性，可作为ICSI精子处理的首选方法[7]。精液处理效果与玻璃纤维的类型、规格和过滤强度直接相关。

1.4血清白蛋白过滤法。

利用不同浓度的血清白蛋白过滤精子的原理来分离优选精子。方法是在试管底部放置20%的白蛋白液，上面放置10%的白蛋白液，在两个液位之间形成界面。将离心洗涤的精子悬浮液覆盖在10%的白蛋白液体上。室温孵化一段时间后，将20%的白蛋白液体离心，收集活动精子，用培养液稀释备用。