【摘要】　目的　研究中药连翘醇提物对恶性胸腹腔积液中原代肿瘤细胞的抗肿瘤作用。　方法　收集25例经病理确诊的恶性胸腹腔积液并分离原代肿瘤细胞,用CCK8法检测原代肿瘤细胞对连翘醇提物及化疗药的药物敏感性,提取细胞RNA,用荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测连翘醇提物对凋亡相关蛋白基因SurvivinmRNA、Bcl-2mRNA表达的作用。　结果　连翘醇提物对4种细胞系(胃癌细胞株BGC-823、肝癌细胞株SMMC-7721、肺癌细胞株A549和大肠癌细胞株LOVO)的半数抑制浓度(IC50)平均值为191.88μg/ml,对25例恶性胸腹腔积液中原代肿瘤细胞IC50平均值为406.13μg/ml,两者无显著差异(P>0.05)。连翘醇提物对大肠癌、胃癌、肺癌及其他消化道肿瘤来源的胸腹腔积液中原代肿瘤细胞的抗肿瘤作用无明显差异(P>0.05)。连翘醇提物对接受化疗患者的胸腹腔积液中原代肿瘤细胞的IC50值为543.13μg/ml,显著高于未接受化疗患者,年龄、性别以及体腔积液类型组间IC50值均无统计学差异。7例对连翘醇提物耐药的原代肿瘤细胞对多西紫杉醇、氟尿嘧啶、顺铂存在交叉耐药,而对化疗药物耐药的原代肿瘤细胞对连翘醇提物无交叉耐药。连翘醇提物对部分细胞系及原代细胞中凋亡相关蛋白SurvivinmRNA和Bcl-2mRNA有下调作用(P<0.05)。　结论　中药连翘醇提物对恶性胸腹腔积液中原代肿瘤细胞,尤其是对化疗药物耐药的原代肿瘤细胞仍有一定的抗肿瘤作用。
【关键词】　连翘;原代肿瘤细胞;恶性胸腹腔积液
    近年来,恶性肿瘤的发病率不断升高,而恶性胸腹腔积液是晚期恶性肿瘤常见的临床表现之一,甚至在一些恶性肿瘤患者中,胸腹腔积液是恶性肿瘤的首发症状[1]。因为恶性肿瘤及恶性胸腹腔积液的治疗过程中常常产生耐药性,使得其目前的治疗效果不佳。中医药早在《黄帝内经》中就有关于恶性胸腹腔积液的相关记载,当前研究显示,很多中成药可以用来做胸腹腔灌注,如榄香烯乳、鸦胆子油乳、香菇多糖等,治疗恶性胸腹腔积液,能够改善症状、延长生存期、改善生存质量等,且不良反应小,体质很差的患者也能接受,在治疗恶性胸腹腔积液中显示出一定的优势[2-4]。但是当前中医药的应用存在一定的经验性,抗肿瘤中药虽然有少量药敏相关研究,但是并未深入开展此项研究,尤其是中医药对恶性胸腹腔积液中原代肿瘤细胞的药敏相关研究,目前尚未见相关报道[5]。在中药的抗肿瘤作用的筛选实验中,已经发现中药连翘具有较好的抗肿瘤、诱导肿瘤细胞凋亡作用,但都局限于其对体外细胞株的作用[6-7]。本文试图发现连翘醇提物对恶性体腔积液中的原代肿瘤细胞尤其是对化疗药耐药的肿瘤细胞的抗肿瘤作用,并对其可能的作用机制进行初步探讨,为进一步临床研究提供依据。
1　材料和方法
1.1　细胞株与细胞培养　人胃癌细胞株BGC-823、肝癌细胞株SMMC-7721、肺癌细胞株A549和大肠癌细胞株LOVO购自中国科学院上海细胞生物研究所,细胞均用含10%小牛血清的RPMI1640,置于37℃、5%二氧化碳(CO2)、饱和湿度培养箱中培养,0.25%胰蛋白酶消化传代。
1.2　药物　连翘醇提物(产地:安徽,用14倍量的80%乙醇连续回流提取2遍,每次1h,挥发干,称浸膏重,再用80%的乙醇溶解,制备成所需的浓度)。多西紫杉醇(Doc)、顺铂(DDP)、5-氟尿嘧啶(5-FU)均购自江苏恒瑞医药公司。所用药物100%测试药物浓度(TDC)分别为:Doc10μg/ml、DDP4.0μg/ml、5-FU40μg/ml[8]。药物敏感性判定:100%TDC浓度下抑制率>50%为高度敏感,抑制率30%～50%为中度敏感,抑制率<30%为不敏感。
1.3　标本收集与原代肿瘤细胞的分离　收集2007年4月至2007年9月经病理科确诊的转移性恶性胸腹水患者25例,其中<60岁12例,>60岁13例,男13例,女12例,平均年龄(62±1.2)岁。其中,胃癌9例,大肠癌4例,肝癌1例,胰腺癌2例,非小细胞肺癌9例。25例患者中,已接受全身化疗的8例。无菌条件下行胸/腹腔穿刺术,抽取恶性积液800～1000ml至无菌容器中并送至实验室。将收集的胸腹水分装至50ml离心管中,1500r/min离心15min,弃上清;在15ml离心管中将7ml细胞悬液小心加至7mlFicoll之上,2200r/min离心25min;吸取中间层至新管;加入40mlD-Hank's液洗涤细胞;如沉淀中含有较多的红细胞,加入红细胞裂解液40ml;用含抗生素RPMI1640再次洗涤细胞,台盼兰染色计算细胞活力。所分离的原代细胞经病理科确诊肿瘤细胞含量>50%。
1.4　CCK8法药物敏感性测定　取1.0×105/ml上述原代细胞接种于96孔U型悬浮培养板中,加入含药物的培养液(每种浓度设立3个复孔),并同时设立空白对照。将细胞置于37℃、5%CO2饱和湿度的培养箱孵育72h后取出,每孔加入10μl的含WST-8的CCK8显色剂(上海同仁化学研究所),继续孵育4h后,自动酶标仪以460nm波长测定各孔的吸光度(A)值,用复孔吸光度平均值进行比较。肿瘤细胞抑制率=(对照孔测定A值-实验孔测定A值)/(对照孔测定A值-空白孔测定A值)×100%。以药物浓度为横坐标,存活率为纵坐标绘制浓度效应曲线,求出回归方程,得出半数抑制浓度(IC50)。
1.5　RNA提取及荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)　取药物作用前后的肿瘤细胞系和原代肿瘤细胞,用PBS缓冲液洗细胞1次去除培养液后,加入1ml总RNA提取试剂TRIZOL,充分混匀后用0.2ml氯仿抽提,等体积异丙醇沉淀,75%乙醇洗涤RNA,空气干燥,加20μl无RNA酶水溶解。按照逆转录试剂盒(Takara)说明书步骤将RNA逆转录为cDNA。荧光定量PCR反应体系总体积为20μl,含SYBRgreen染料(Takara)10μl(2×),引物1μl,cDNA2μl。每个基因做3个复孔。PCR扩增条件为:95℃10s1个循环,95℃5s、60℃20s45个循环。熔融曲线反应条件为:95℃10s,以每秒0.1℃的速度从65℃上升至95℃,排除非特异性扩增。软件分析其Ct值。以人总RNA(Clontech)作为校正,由公式2-(ΔCtsample-ΔCtcalibrator)计算凋亡抑制基因与β-actin的相对定量值。
1.6　数据分析与统计　组间差异用Student-t检验,相关性分析采用Pearsons相关性分析,P<0.05表示差异有统计学意义。统计软件为SPSS11.5。
2　结果
2.1　连翘醇提物对肿瘤细胞系及原代肿瘤细胞的作用　连翘醇提物对4种细胞系的生长抑制曲线见图1。连翘醇提物对细胞系的抗肿瘤作用呈浓度依赖性,对胃癌细胞株BGC-823、肝癌细胞株SMMC-7721、肺癌细胞株A549和大肠癌细胞株LOVO的IC50值分别为152μg/ml、178.5μg/ml、202μg/ml、235μg/ml,平均为191.88μg/ml。在恶性胸腹水原代肿瘤细胞的研究中,连翘醇提物对原代肿瘤细胞的IC50平均值为406.13μg/ml,与细胞系的IC50值无统计学差异,对胃癌、大肠癌、肺癌及其他消化道肿瘤来源的胸腹腔积液中原代肿瘤细胞的抗肿瘤作用无明显差异(P>0.05)。连翘醇提物对接受化疗患者的胸腹腔积液中原代肿瘤细胞的IC50值显著高于未接受化疗患者(P<0.05),不同年龄、性别、体腔积液类型组间IC50值均无统计学差异。见表1。
图1　连翘醇提物对4种细胞系的生长抑制曲线
表1　连翘醇提物对25例恶性胸腹水中原代肿瘤细胞的IC50值(x±s,μg/ml)
2.2　连翘醇提物与化疗药的交叉耐药特性　在收集的25例原代肿瘤细胞中,连翘醇提物IC50值>800μg/ml的耐药细胞共有7例,分别为肺癌3例、胃癌3例、肝癌1例。这7例原代肿瘤细胞对临床常用的Doc+DDP+5-FU化疗药物均有不同程度的交叉耐药。我们进一步研究了对化疗药物耐药的原代肿瘤细胞对连翘醇提物的耐药特性。我们收集了1例接受DFP方案(Doc+DDP+5-FU)化疗的胃癌患者在3个不同治疗阶段(治疗前、DFP方案治疗1周期后及DFP方案治疗3周期后)的恶性腹水,并比较各种药物对不同阶段原代肿瘤细胞的抑制率。经DFP方案治疗后恶性腹腔积液中的原代肿瘤细胞对Doc及DDP的药物敏感性显著下降(P<0.05),但连翘醇提物(200μg/ml)对该耐药细胞仍有一定抑制作用。见表2。
表2　连翘醇提物对化疗药耐药原代肿瘤细胞的作用(%)
2.3　连翘醇提物对凋亡相关蛋白的作用　为研究连翘醇提物对原代肿瘤细胞抗肿瘤作用可能的相关机制,本研究测定了连翘醇提物对胃癌、肺癌、大肠癌、肝癌细胞系及相应原代细胞凋亡相关基因SurvivinmRNA表达的改变。实验发现,以不加连翘醇提物的细胞作为对照,连翘醇提物作用72h后Bcl-2mRNA表达在BGC-823、SMMC-7721、A549、LOVO和肺癌源性恶性胸腔积液P-Lu18、大肠癌源性腹腔积液A-Co20中明显下调(P<0.05)。见图2。本研究同时测定了连翘醇提物对胃癌、肺癌、大肠癌、肝癌细胞系及相应原代细胞凋亡相关基因Bcl-2mRNA表达的改变。实验发现连翘醇提物作用72h后SurvivinmRNA表达在A549、LOVO和肺癌源性恶性胸腔积液P-Lu18、大肠癌源性腹腔积液A-Co20中明显下调(P<0.05)。见图3。
3　讨论
    连翘为木犀科植物连翘的干燥果实,中医认为连翘苦、微寒,归肺、心、小肠经,能清热解毒,消肿散结,可用于痈疽,瘰疬,乳痈,丹毒,风热感冒,温病初起,温热入营,高热烦渴,神昏发斑,热淋尿闭。连翘的成分主要包括木脂素类、黄酮类、三萜类以及棕榈酸等。Chen等[9]研究发现连翘的鞣质成分能够在体外抑制乳腺癌肿瘤细胞MDA231的迁移,并且可能抑制血管生成。连翘抗肿瘤的有效成分研究未见更多的深入报道,其抗肿瘤研究主要是临床的抗肿瘤中药方剂中包含有连翘这一味中药[10-11]。武汉大学程祥等申请一项连翘抗肿瘤相关研究的专利(申请号/专利号:200710052545),将连翘醇提物与药用载体和(或)赋形剂制得药用组合物,所制得的药用组合物用于抗肿瘤化疗增敏减毒,具有疗效好、不良反应少、提高患者生存质量等优点。由于连翘有一定的抗肿瘤活性,具有体内低毒性、天然资源含量丰富等特点,使其有望被开发成一种新型的抗肿瘤药物。
图2　连翘醇提物对SurvivinmRNA表达水平的作用
图3　连翘醇提物对Bcl-2mRNA表达水平的作用
    本实验在前期的中药抗肿瘤作用筛选中已经发现,11种中药的醇提物对胃癌细胞株BGC-823和AGS有较强的抑制作用,其中连翘醇提物对胃癌细胞株BGC-823的抑制率均>70%,有较强的抗肿瘤作用。进一步筛选15种传统中药的醇提物和水提物的抗肿瘤作用,用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测了6种消化系统肿瘤细胞株,发现15种中药的醇提物比水提物的抗肿瘤作用更强,其中连翘可见较好的抗肿瘤作用[12]。两项均研究探讨了某些传统中药具有一定的抗肿瘤作用,且其醇提物比水提物效果更好,说明某些中药的用药方式不能只局限于传统的水煎方式。胡文静等[6]发现连翘乙醇提取物体外对人肝癌细胞株SMMC-7721、人肠癌细胞株LOVO、人胃低分化腺癌细胞株BGC-823和小鼠H22肝癌细胞均有明显的抑制作用,高低剂量组体内对H22小鼠肝癌抑瘤率分别为53.24%、35.25%,显示连翘醇提物体内、外实验具有显著的抗肿瘤活性。许萍等[7]发现连翘醇提物作用于BGC-823细胞24h、48h和72h均有明显抑制作用,且其作用呈明显的时效和剂量关系,并且探讨连翘醇提物对BGC-823细胞抑制增殖作用的机制可能与诱导肿瘤细胞凋亡有关。
    本研究显示连翘醇提物对恶性胸腹腔积液中原代肿瘤细胞有较好的细胞毒作用,并与化疗药的作用相比较,发现连翘对化疗耐药的原代肿瘤细胞仍然具有一定的抑制作用。实验初步探讨了连翘抗肿瘤的作用机制,认为可能与下调Survivin和Bcl-2有关,为进一步的临床研究提供了参考。下一步研究需要更多病例的恶性胸腹腔积液扩大样本量,进一步研究恶性胸腹腔积液对其他中药的敏感性[13]。中药连翘化学成分复杂,药理活性强,临床应用范围广,但其成分和作用机制仍未完全明确。近年来国内外学者着眼于中药生理活性和独特的药用价值,以中医理论为指导,通过现代药理研究,提取筛选其有效成分,为中药的临床应用提供了理论依据。
[参考文献]
[1]MonteSA,EhyaH,LangWR.Positiveeffusioncytologyastheinitialpresentationofmalignancy[J].ActaCytol,1987,31(4):448-452.
[2]　罗海英,徐凯,刘朝阳.腹水超滤回输腹腔并腔内灌注榄香烯乳治疗癌性腹水的疗效观察[J].广州中医药大学学报,2004,21(3):179-181.
[3]　姚亚民,赵艳秋.康莱特注射液联合顺铂治疗癌性胸水85例临床疗效观察[J].临床肿瘤学杂志,2007,12(4):305-306.
[4]　刘云霞,杨洁文,姚勇伟.胸腔置管引流并腔内鸦胆子油乳注射治疗癌性胸水疗效分析[J].实用中医药杂志,2005,21(1):4-5.
[5]　汪波.MTT体外药敏实验评价中药在乳腺癌化疗中的意362实用老年医学2009年10月第23卷第5期　PractGeriatr,October2009,Vol.23,No.5义[J].中医药学刊,2002,20(2):254-256.
[6]　胡文静,钱晓萍,涂云霞,等.连翘乙醇提取物抗肿瘤作用的实验研究[J].南京中医药大学学报,2007,23(6):379-381.
[7]　许萍,孙婧,胡文静,等.连翘乙醇提取物对人胃癌细胞株BGC-823增殖和凋亡的影响[J].医学研究生学报,2007,20(12):1235-1238.
[8]NealeMH,LamontA,HindleyA,etal.Theexvivoeffectofhighconcentrationsofdoxorubicinonrecurrentovariancarcinoma[J].AnticancerDrugs,2000,11(10):865-871.
[9]　ChenX,BeutlerJA,McCloudTG,etal.TannicacidisaninhibitorofCXCL12(SDF-1alpha)/CXCR4withantiangiogenicactivity[J].ClinCancerRes,2003,9(8):3115-3123.
[10]岳松滨,吴其林,王瑞征,等.中西医结合治疗晚期恶性肿瘤的疗效观察[J].西南国防医药,1999,9(4):245-246.
[11]杨文华,杨向东,汤毅,等.中西医结合单元疗法治疗急性白血病81例[J].辽宁中医杂志,2007,34(1):72-73.
[12]SunJ,LiuBR,HuWJ,etal.InvitroanticanceractivityofaqueousextractsandethanolextractsoffifteentraditionalChinesemedicinesonhumandigestivetumorcelllines[J].PhytotherRes,2007,21(11):1102-1104.
[13]刘广遐,王婷婷,胡文静,等.重楼醇提物对恶性胸腹水中原代肿瘤细胞的抗肿瘤作用[J].实用老年医学,2008,22(2):101-104.