【摘要】人类血小板具有多种血型系统, 表面存在复杂的血型抗原, 反复多次妊娠[1]可能使母体产生针对胎儿血小板抗原的抗体, 引起胎儿血小板数目减少, 严重时可导致流产、免疫性血小板减少性紫癜和颅内出血等一系列疾病, 因而及时快速检测出血小板抗体对于预防此类情况的发生具有重要意义。近年来, 随着检验医学技术的进步以及对血小板抗原抗体本质研究的进一步深入, 血小板抗原, 尤其是血小板特异性抗原的遗传学多态性和抗原特性逐步被发现, 血小板血型的抗原抗体检测方法已经从血清学方法逐渐过渡到了分子生物学方法与血清学方法共存的时代。尽管血小板抗原抗体检测手段的完善对由血小板抗体所导致疾病的预防和治疗具有重要的临床意义, 但是各种检测方法均具有自身特点, 本文就此类问题作一综述。
孕妇血小板抗原抗体检测方法的综述
1、血小板抗原与血小板抗体
1.1、血小板抗原
人类血小板表面的血型抗原主要分为两大类:一类是血小板非特异性抗原, 此类抗原并非血小板所特有, 而是与其他组织或血细胞所共有, 因此又称为血小板相关抗原, 它主要包括ABO血型抗原和人类白细胞抗原 (human leukocyte antigen, HLA) , 这一类抗原主要是血浆成分吸附于血小板表面形成的, 我们通常所说的血小板相关抗原指的是HLA;另一类是存在于血小板膜糖蛋白上的血小板特异性抗原, 称之为人类血小板抗原 (human platelet antigen, HPA) , 这类抗原只存在于血小板表面, 由特定的遗传基因编码, 表现为血小板独特的遗传多态性。尽管ABO抗原、HLA和HPA都表达于血小板, 但HPA最常参与胎儿或新生儿同种免疫性血小板减少症的发生, 因此成为学者们广泛研究的目标[2]。
1.2、血小板抗体
与血小板抗原相对应, 人类血小板抗体也主要分为两大类:一类为针对血小板非特异性抗原的抗体, 其中主要为抗HLA-Ⅰ, 简称为抗HLA, 此抗体在同种免疫反应中产生率较高, 但血小板输注无效的发生率却较低, 国外研究显示, 产过患血小板减少症新生儿的母亲与正常母亲相比, 其抗HLA-Ⅰ的阳性率升高[3], 这类抗体的存在也被发现与患有血小板减少症新生儿的出生时低体重有关[4];另一类为针对HPA的抗HPA, 我们称之为血小板特异性抗体, 此类抗体虽然产生率低, 但是它导致的血小板输注无效比抗HLA更为常见, 它也是导致胎儿或新生儿出现同种免疫性血小板减少症的直接致病抗体。
2、血小板抗体的产生及致病机制
2.1、同种免疫性因素
同种免疫性因素多是由于母胎间血小板血型不合引起的, 若父母的血小板表面抗原不相容, 胎儿又恰好遗传了父亲的血小板表面抗原基因, 即可导致母亲与胎儿的血小板表面抗原也不相容, 胎儿血小板通过胎盘屏障进入母体血液循环后刺激母体免疫系统产生针对不相容同种异体抗原的血小板抗体, 此类抗体主要为Ig G类抗体, 该Ig G类抗体又通过胎盘屏障输入回胎儿体内, 与胎儿血小板发生抗原抗体反应后被单核-吞噬细胞清除而导致胎儿血小板减少。有文献报道, 孕妇在此次怀孕前有多次妊娠史和输血史[5], 其血小板抗体阳性率明显高于初次妊娠和没有输过血液制品的孕妇, 且随着次数的增加, 孕妇体内产生血小板抗体的几率也随之增高[6]。这些母亲的同种异体抗体不仅会破坏和抑制胎儿血小板的产生, 而且还会影响血管壁的完整性, 从而增加胎儿和新生儿颅内和颅外出血并发症的发生风险, 并可能导致宫内和围产期死亡[7-9]。
2.2、自身免疫性因素
患有某些自身免疫性疾病如系统性红斑狼疮、甲状腺功能亢进、特发性免疫性血小板减少性紫癜的孕妇, 其自身免疫调节功能发生异常, 会产生针对自身血小板的抗体, 该抗体同样可以通过胎盘循环进入胎儿体内, 通过抗原抗体反应致胎儿血小板数目减少, 严重者会导致新生儿出现颅内出血[10]。
3、新生儿同种免疫性血小板减少症 (neonatal alloim-mune thrombocytopenia, NAIT)
NAIT是由于同种免疫性因素导致胎儿血小板减少的一种疾病[11]。该病在高加索人群的发病率约为0.1%[12-13], 且大于75%的病例是由于抗HPA-1a导致, 在日本人群中的发病率约为0.15%, 主要由抗HPA-5b导致, 但在我国目前尚没有这方面的统计数据。虽然许多病例症状是轻微的, 但它仍是造成新生儿严重血小板减少 (血小板计数<50×109/L) 的最常见原因。该病的临床表现类似于新生儿溶血性疾病, 主要表现为胎儿和新生儿全身广泛的出血, 新生儿出生时全身皮肤可出现瘀点和瘀斑, 或出生时正常, 于数天后才出现血小板减少的一系列临床症状, 该病的实验室检查结果为血小板抗体阳性、血小板显着减少, 该病发病较急, 是导致胎儿和新生儿出现严重血小板减少症及颅内出血[14-15]的最常见病因[16], 颅内出血患儿有时会出现严重的神经并发症, 病死率可达9%~46%[15,17]。在国外一项调查中发现[18], 在有颅内出血的新生儿中, 男性所占比例 (76%) 比女性要高得多, 其相关性还有待于进一步研究。
4、血小板抗体检测方法
目前比较常见的血小板抗体检测方法有微柱凝胶免疫法 (micro-column gel immunoassay analysis, MGIA) 、固相红细胞黏附试验 (solid-phase red cell adherence assay, SPRCA) 、简易致敏红细胞血小板血清学试验 (simplified sensitized erythrocyte platelet serology assay, SEPSA) 、单克隆抗体特异性血小板抗原固定术 (monoclonal antibody specific immobilization of platelet antigen, MAIPA) 、抗原捕获酶联免疫吸附试验 (modified antigen capture ELISA, MACE) 、流式细胞术 (flow cytometry, FCM) 、血小板抗体珠阵列 (platelet antibody bead array, PABA) 。MAIPA和MACE是目前国内外普遍采用的血小板抗体血清学检测方法。
MGIA的检测原理为将待测血清、血小板抗原和包被有抗人Ig G的指示红细胞依次加入微柱凝胶中, 如果待测血清中存在血小板抗体, 则在凝胶中形成血小板-血小板抗体-指示红细胞免疫复合物, 离心后该复合物仍弥散悬浮于凝胶管中;若待测血清中无血小板抗体, 经过离心后在凝胶管底部形成容易辨认的指示红细胞沉淀, 但MGIA法的假阳性率高, 灵敏度及特异度低, 且需要解决血小板在实验中的自凝问题, 目前很少应用于孕妇血小板抗体检测中。SPRCA、SEPSA和MAIPA都是基于抗原抗体反应的固相凝集技术, 供者血小板抗原通过离心固定在经过特殊处理的微孔内表面, 洗去多余的血小板抗原, 将待测血清和稀释液加入相应的微孔中孵育, 孵育结束后, 洗去未结合的血清部分, 加入抗人Ig G和人Ig G致敏红细胞 (指示红细胞) 后离心, 如果待测血清中存在血小板抗体, 则该抗体包被于血小板抗原上, 抗人Ig G与血小板抗体结合, 指示红细胞通过抗人Ig G搭桥而固定于微孔底部, 因此, 指示红细胞弥散分布于反应孔底部为阳性, 聚集在反应孔底部中央则为阴性。MAIPA法敏感性和特异性强, 方便临床应用, 且易于标准化[19], 成为国内外孕妇血小板抗体检测的主要方法, 更被国际上公认为是鉴定血小板同种抗体的金标准[20]。MACE试验的微孔底部包被有血小板抗原, 微孔中加入稀释液及待测血清后孵育、洗涤, 后加入酶标抗人Ig G试剂, 孵育、洗涤后加入显色剂避光静置, 最后加入终止液, 测405nm处的OD值, 若OD值>2倍阴性对照值即为阳性, 反之为阴性。该方法的优点为可以根据微孔中包被抗原的特异性来确定所检测抗体的特异性, 能够同时检测孕妇血清中的抗HLA和抗HPA[21], 并能区分抗HPA的特异性, 满足了孕妇血小板抗原抗体特异性检测的要求, 目前正广泛应用于临床孕妇血小板抗体检测中。
FCM和PABA是近些年新兴的血小板抗体检测技术。FMC是通过免疫荧光技术进行血小板抗体的检测, 以平均荧光强度为检测指标, 结合阴性对照及阳性对照的检测结果, 确定标本中是否含有血小板抗体, 国外还曾报道过该检测方法与微球结合的Luminex新型检测技术[22-23], 是血小板抗体检测技术的又一进步。PABA[24-26]是一种利用血小板抗体珠来检测血小板特异性抗体的检测方法, 患者血清中的抗HLA及抗HPA可以同时在一个微板块中检测到, 是一种具有高敏感性和高特异性的、简单快速而又高通量的基于多重蛋白的检测人类血小板抗体的方法, 这样一个平台将有助于识别特异性血小板抗体。FCM和PABA阳性率高, 敏感度好, 且可以实现电子化、程序化、标准化检测, 但所用仪器和试剂成本高, 目前并未在临床孕妇血小板抗体检测中得到推广。
5、HLA及HPA基因检测技术
虽然孕妇血小板抗体血清学检测技术越来越成熟, 但并不能满足现代医学发展的需要, 越来越多的人开始关注血小板抗原基因型, 以求从更深的层面解释NAIT疾病的发生发展。在孕妇HLA和HPA基因检测中, 应用最多的为聚合酶链反应 (PCR) 衍生技术, 包括PCR-限制性片段长度多态性 (PCR-RFLP) 、PCR-序列特异性引物 (PCR-SSP) 、PCR-直接碱基序列分析 (PCR-SBT) 及Taq Man荧光定量PCR (Taq Man Realtime PCR) 等。PCR-RFLP是较早应用于孕妇HLA和HPA基因检测中的分子生物学技术, 但由于其操作复杂、分辨率低等缺点逐渐被其他技术取代。PCR-SSP法是利用已经设计好的序列特异性引物扩增基因片段, 扩增产物进行凝胶电泳检测, 根据电泳条带结果判读HLA或HPA基因型, 此法操作相对简单、成本低, 但不能自动化检测, 不易发现新的等位基因。PCR-SBT法是孕妇HLA和HPA基因型检测的金标准, 可直接对扩增产物进行碱基序列测定, 根据碱基序列分析基因型, 并且易于发现新的等位基因。Taq Man Real-time PCR是利用特异性荧光探针进行检测, 根据最终荧光信号强度判读与探针结合的DNA分子数, 该法操作简单, 利用荧光定量PCR仪直接判断检测结果, 准确度及精确度高, 但成本昂贵, 未广泛应用于临床孕妇HLA和HPA基因检测中。目前国内外孕妇HLA及HPA基因分型应用最多的为PCR-SSP和PCR-SBT。
除了以PCR为基础的基因分型技术外, 一些更为先进的技术也正在服务于孕妇HLA和HPA基因检测中。基因芯片技术的检测原理为采用多重PCR及连接酶技术对目标基因进行扩增, 然后将扩增产物与包被探针的微球进行杂交, 通过芯片阅读仪判定目标基因的基因型。我国西安地区通过Bio-Plex悬浮芯片对部分献血者进行HPA1-16基因分型[27], 其基因型和等位基因频率与PCR-SBT方法的检测结果一致, 成功建立了一种基于基因芯片技术的HPA基因分型方法, 与传统的PCR技术相比, 具有高准确率、高通量等特点, 并为临床孕妇及血小板捐献者进行HPA基因分型的检测提供基础。二代测序技术是在第一代测序技术的基础上发展起来的, 又名高通量测序技术, 广泛应用于土壤、人体、海洋及污水等微生物基因检测中[28], 在临床医学已经应用于肿瘤学、遗传病筛查、病原微生物检测及药物基因学等方面[29], 国外文献报道[30-31], 目前二代测序技术已经应用于HLA基因分型检测, 这是测序技术史上的又一次创新性进步。二代测序技术可以实现对HLA多态性区域[32]及全基因组[33]的测序分型, 包括454测序系统、Ion PGM系统、Miseq/Hiseq测序系统和SMRT测序仪, 具有高分辨率、高通量、费用低等优点, 有助于发现孕妇新的HLA等位基因, 并探讨HLA基因型与抗HPA抗原特异性的关系, 但二代测序技术在HLA基因分型方面目前还不够成熟, 仅应用于科研, 并未应用于临床。
6、血小板抗原抗体检测的临床意义
6.1、早期诊断
鉴于血小板抗体带来的严重不良后果, 因此孕妇孕期血小板抗体的检测是必不可少的, 特别是有多次流产史、妊娠史、输血史和伴有自身免疫性疾病的孕妇, 筛查血小板抗体尤为重要, 它能够有效地探讨反复流产的病因、早期预测及预防新生儿同种免疫性血小板减少症的发生。
6.2、早期治疗
对于抗HPA阳性的孕妇, 应引起医生及孕妇的高度重视, 可于孕12~20周时静脉注射丙种免疫球蛋白或在孕后期结合激素治疗来预防NAIT的发生[34], 国外也曾报道过通过体外受精成功避免NAIT发生的案例[35]。若产后新生儿发生血小板减少症, 应视其血小板计数结果和临床症状的严重程度进行静脉丙种免疫球蛋白注射[36]或血小板输注治疗。有条件的医院可以应用分子生物学技术进一步对患儿及其父母进行HLA及HPA基因分型检测, 根据相应的抗原进行抗体特异性分析, 以明确病因及指导临床治疗。
6.3、优生优育
同时我们也建议育龄期妇女在孕前进行血小板抗体的筛查, 评估由于血小板抗体引起的早期流产和NAIT的发生概率, 确保优生优育。
7、展望
虽然NAIT已经得到越来越多人的关注, 但都是由于生产过患有此病的新生儿后才被发现, 目前大部分国家都没有开展对该病的筛查工作和对该病的风险评估, 这可以成为妇产科、儿科及输血科共同的研究方向。文献报道, 在亚洲人口中与免疫介导的血小板减少有关的最重要的血小板抗体是抗HPA-3和抗HPA-4[37], 其中并未包括我国, 而目前我国只是部分地区建立了血小板HLA或HPA基因型资料库[38-41], 其抗原基因型都有区域性分布特征。因此每个地区都应调查本地区HLA和HPA基因型分布特征, 掌握本地区的优势同种抗原及高危抗原系统, 针对特殊人群如孕妇、患有自身免疫性血小板减少症的患者进行血小板抗体筛查, 同时建立本地区血小板捐献者HLA和HPA基因型资料库, 以便能达到HLA血型和HPA血型均匹配的血小板输注治疗, 这样可以减少血小板输注无效的发生, 孕妇及伴有血小板减少的患者能及时、有效地输注血小板制剂, 节约医疗资源, 提高临床治疗效果, 更有重要的免疫学意义和社会效益。
参考文献
[1]谢仁伟, 王明泉, 李丽群, 等.孕晚期孕妇2038例血小板抗体筛查分析[J].福建医药杂志, 2016, 38 (2) :98-99.
