血管增殖、迁移、泡沫和凋亡以及冠状动脉旁路移植术(CABG)和经皮冠状动脉内血管成形术(PTCA)后血管再次狭窄，颈动脉球囊损伤术引起的新生内膜形成(Neointimaforman)和动脉粥样硬化(AT~4)密切相关。因此，VSMCs增殖和迁移的研究已成为血管生物学研究的热点。本研究在[5~8]的基础上参考国内外文献，结合自身经验，采用改进的植块粘壁法成功建立了大鼠胸主动脉平滑肌的培养模型。

一、材料和方法。

1.1由中山大学实验动物中心提供的动物和试剂SPF级雄性SD大鼠1只，重量（150±10）g，证书编号（广东监督证书2006064）。DMEM（Gibco）、胎儿血清（杭州四季青生物工程材料研究所）、胰蛋白酶（trypsin、Sigma）、T25塑料培养瓶（Costar）、特异性大鼠平滑肌动蛋白抗体、SABC试剂盒、DAB显色试剂盒（武汉博士德公司）、FITC标志羊抗鼠荧光二次试剂（SantacruzBiochem）

1.2大鼠VSMCs的分离与原来培养的1只SPF级雄性SD大鼠分开，重约150克，颈椎脱位处死，75%乙醇浸泡消毒2分钟。同时，大鼠的胸部和腹部用酒精浇水，然后移入超级干净的平台。在无菌条件下，快速取出整个胸部主动脉，并立即将其移入含有冷PBS的无菌平皿中。使用1ml一次性注射器拔出针尖，吸收PBS清洗以去除血液污染。眼科镊子去除外膜结缔组织。此时，将清洁血管转移到另一个含有冷PBS的无菌平皿中。用眼科切割小心地切割血管绒毛，然后用两个弯曲镊子反向拉动以去除外膜，然后用眼科弯曲镊子沿血管两端来回拉动一次，纵向切开血管，使内膜面朝上，用弯曲镊子将血管平整，然后将血管转移到含有DMEM（10%胎牛血清）的无菌平皿中。用DMEM培养液清洗膜层光滑肌几次后，用眼科弯曲剪切成约1mm3大小的组织块；将组织块（约15小块/段血管）均匀粘贴在25厘米2培养瓶底部的一个角落，间距0.1厘米；将含有2ml2%胎牛血清的DMEM培养液添加到瓶中，将培养瓶直立在37℃，在5%CO2培养箱中，使组织块干燥，并牢牢粘贴在瓶壁上。6小时后，再次翻转培养瓶，使组织块浸入培养液中。培养箱静置3天后，从组织块边缘游出细胞后更换培养液，第二天更换一次；当80%的细胞融合时，它们可以被传递。

1.3VSMCs的传代培养。当组织块周围的外部细胞相互融合80%时，可以传递：在超净平台中，吸收废弃的旧培养液，将组织块转移到一个新的培养瓶中，并将其添加到培养基中进行进一步培养。使用不含血清的DMEM培养液清洗细胞两次，添加0.125%胰酶和0.02%EDTA混合消化液2ml，在室温下消化20秒，然后转移到37℃培养箱进行消化1min。在镜子下观察，当发现细胞收缩，间隙增加，少数细胞脱落时，丢弃消化液，添加含有20%胎牛血清的DMEM培养液，10ml终止消化，反复吹瓶壁细胞进入单细胞悬浮液，按1:3接种疫苗，细胞密度保持在1×106cels/ml，在大约3天内完成单层，并以相同的方式继续培养。

1.4第三代VSMCs悬液9滴，期待蓝色染色鉴定，取代细胞活力，取代细胞活力9滴，加1滴0.4%期待蓝色液体(Sigma)，立即混合，吸收1滴在细胞计数板上，观察光学显微镜下:非色细胞是活细胞。根据成活率=非色细胞数/500×100%计算随机计数5个视野，共计数500个细胞。

1.鉴定5VSMCs。

1.5.1VSMCs的形态学观察组织块连续观察细胞的大小、形状、生长特征和排列，并在倒置差异显微镜下拍照记录2天后。

1.5.2VSMCs的免疫组化鉴定取第三代对数生长期细胞悬浮液1×106cells/ml接种疫苗6孔板预放置盖片，放置37℃，在5%CO2培养箱中培养，当细胞生长成致密单层时，取出盖片，PBS冲洗5min×3次，在4%多聚甲醛室温下固定20~30min，PBS再次冲洗5mi×3次，然后根据SABC免疫组化试剂盒和DAB显色试剂盒的说明逐一操作（一种是抗鼠平滑肌，一种是抗鼠平滑肌，一种是抗鼠，一种是抗鼠，一种是抗鼠，一种是抗鼠，一种是抗鼠，一种是抗鼠，一种是抗鼠，一种是抗鼠，一种是抗鼠，一种是抗鼠，一种是抗鼠，一种是抗鼠，一种是抗鼠，一种是抗鼠，一种是抗甲，一种是抗甲。然后用苏木素重新染色，密封，并在差异显微镜下观察。细胞浆呈棕黄色为阳性细胞，计数500个细胞，计算阳性率。

1.5.3免疫荧光染色采用第三代细胞进行细胞爬板，4%多聚甲醛固定10min，PBS洗3次，1%TritonX-100渗透细胞膜30min，正常山羊血清37℃封闭60min，加1抗(α-SM-actin1:200稀释，Boster)4孵化过夜，PBS洗3次，加入FITC标志山羊抗鼠二抗鼠二抗鼠二抗(Santacruz)37℃孵育1h，PBS洗3次，加5g/mlhoechoc3342，室温孵育5~10min，PBS全洗，甘油封片，移动荧光显微镜(Olympus，Tokyo，Japan)观察摄片。

1.6VSMC的生长曲线取第三代细胞，生长状态良好，常规胰酶消化传代，制成细胞密度1×104cels/ml的单细胞悬浮液，接种于24个孔板，500μls/孔，放置37℃，在5%CO2培养箱中培养，每24小时收集3个孔，加入50μLMTT(5mg/ml)，继续培养4小时，排出液体，加入750μLDMSO溶解，振动10分钟，转移到96孔板，然后在酶标仪上读取570nm的OD值，计算其平均值。VSMC的生长曲线是用Sigmaplot10.0软件绘制的，以培养时间为横轴，以细胞活力(OD570nm)为纵轴。

1.7VSMCs的冷冻存储和复苏取第二代对数生长期细胞，并在冷冻存储前一天更换液体。消化细胞收集到离心管、计数、离心废弃和清除，并添加冷冻液体（DMSO、血清和DMEM培养基），以1∶6∶3的方式制备，现在将其并存4℃备用），使细胞的最终密度为5×106~1×107/ml，分别放入1.2ml冷冻管中，放入4℃冰箱冷却1小时，然后转移到-20℃冰箱冷却2小时，最后在-80℃冰箱过夜冷却，第二天转移到液氮罐冷冻。复苏时，从液氮罐中取出冷冻储存管，直接放入37℃的水浴箱中，使其在1min内熔化。酒精棉球擦拭冷冻储存管，移入超级平台，用吸管吸出细胞悬浮液，转移到15ml离心管中，加入20%血清培养液，放入离心，再次加入培养液稀释，放入培养箱，放入培养箱，第二天放入静态培养。