摘要:目的研究热毒宁注射液及其组分对流感病毒神经氨酸酶(NA)抑制活性｡方法通过测定流感病毒NA的荧光强度值来确定热毒宁注射液及其组分对流感病毒NA的抑制活性｡结果热毒宁注射液对H1N1､H3N2､B流感病毒NA抑制活性较高,半数抑制浓度(IC50)分别为(46.49±2.25)､(49.77±1.77)､(45.33±5.32)μg/mL｡金银花聚酰胺柱洗脱浓缩液､醋酸乙酯萃取液及残液､柱色谱提取物､隐绿原酸､异绿原酸A和异绿原酸B对H1N1､H3N2､B流感病毒NA酶活性均具有抑制作用｡结论热毒宁注射液及其有机酸类成分对流感病毒神经氨酸酶活性均具有一定抑制作用｡
关键词:热毒宁注射液;流感病毒;神经氨酸酶
    流感病毒属于正黏病毒科,为负链RNA病毒｡其表面分布着3种重要的蛋白刺突,其中两种是糖蛋白,分别是神经氨酸酶(neuraminidase,NA)和血凝素(hemagglutinin,HA),第3种是基质蛋白M2｡NA具有病毒复制所必需的酶活性,促进新形成的病毒粒子从感染细胞中分离与扩散,促进病毒粒子从感染的呼吸道黏膜向周围组织扩散[1-2];此外NA还同样具有病毒的致病性,通过改变表面糖蛋白–血凝素(HA)的碳水化合物部分,增强病毒株的毒性;可直接激活TGF-β,升高的活性细胞因子浓度能引起细胞的凋亡,引起流感症状和气道炎症的发生[3]｡另外,NA活性位点的氨基酸序列在甲乙型流感病毒中高度保守,不因病毒株变异而改变其结构和功能,加之NA酶晶体结构已被解析[4],因此,NA是抗流感病毒的重要靶点,NA抑制剂是今后开发抗流感药物的研究热点[5]｡通过抑制NA活性,可有效地控制甲型､乙型流感病毒感染引起的流感症状和疾病的传播[6]｡目前已在临床上使用的NA酶抑制剂包括扎那米韦和奥司他韦｡然而,NA突变而造成的耐药病毒株的出现和药物的副作用,使得扎那米韦和奥司他韦的使用受到了限制｡因此,迫切需要开发新型的NA抑制剂[7]｡
中医药抗流感在我国有着悠久的历史,抗流感药物方面民间流传着大量的古方､验方､秘方｡近些年来,也有不少研究者对中药抗流感效果和机制进行了研究报道｡然而,还没有任何报道从中药抑制NA活性角度来研究中药抗流感作用｡
    热毒宁注射液为中药注射液,由青蒿､金银花等组成,临床主要用于呼吸道感染引的高热,对多种呼吸道病毒株致培养细胞病变均有明显抑制作用,对多种细菌菌株的生长亦有一定的抑制作用,另外具有较好的抗炎､增强机体的免疫功能,提高抗病力｡热毒宁注射液主要组成药物金银花含挥发油､黄酮类､有机酸､三萜类及无机元素,具有抗菌､抗病毒､增强免疫功能､抗炎解热等作用[8]｡本实验采用经典的NA活性检测方法[9]观察热毒宁注射液､金银花4个提取物及热毒宁注射液HPLC指纹图谱色谱峰的指认9个化合物对流感病毒NA的抑制活性｡
1材料
1.1药物
    热毒宁注射液由江苏康缘药业股份有限公司提供,规格:26g生药/10mL,批号120607;金银花药材购自山东省平邑县,经本课题组鉴定为忍冬科植物忍冬LonicerajaponicaThunb.的干燥花蕾或带初开的花;扎那米韦,葛兰素威康制药有限公司,规格:5mg/片,批号120121;断氧马钱子苷,江苏康缘药业股份有限公司自制,HPLC法测定质量分数≥98%,批号20120316,规格:20mg/支;绿原酸(批号110753-201214)､隐绿原酸(批号MUST-11112203)､新绿原酸(批号MUST-12112001)､咖啡酸(批号110885-200102)､栀子苷(批号110749-201115)､异绿原酸A(批号111782-201203)､异绿原酸B(批号MUST-11083102)､异绿原酸C,(批号111894-201102)规格均为20mg/支,由中国食品药品检定研究院提供｡
1.2试剂与仪器
2-(4-methylumbelliferyl)-α-D-acetylneuraminicacid(MUNANA)､2-N-吗啡林-乙磺酸(MES)购自Sigma公司;氯化钙(CaCl2)､氢氧化钠(NaOH)和乙醇均为分析纯,购自北京化学试剂公司;Fluostargalary微板光学测定仪及配套荧光测定96孔板购自德国BMG公司｡
1.3病毒
流感病毒A/PR/8/34(H1N1)､A/Sydney/5/97(H3N2),B/Jiangsu/10/2003(B)由中国疾病预防控制中心流感病毒中心提供｡
2方法
2.1样品制备
    取金银花药材200g,加入18倍药材量的沸水,提取2次,每次1h,收集等倍量药材的蒸溜液待用,提取液浓缩至相对密度为1.10(70~80℃)后,待用｡加入乙醇适量,使乙醇体积分数达到75%,静置36h,滤过,取滤液备用｡滤液减压浓缩至无醇味(药材等倍量体积),以10%NaHCO3调节pH6.0,药液过D401大孔树脂柱(柱体积2倍药材量),收集过柱后水液;树脂柱以2BV10%乙醇洗脱,收集洗脱液｡将水洗脱液和乙醇洗脱液分别用10%HCl调节pH3.0,浓缩至药材等倍体积,合并,滤过后上聚酰胺柱吸附(柱体积2倍药材量),以水洗脱至药液近无色,再用2BV50%乙醇洗脱,收集洗脱液,回收乙醇至无醇味,用等倍醋酸乙酯萃取6次,浓缩,析出,抽滤,洗涤,减压干燥,得到4个样品:水提取浓缩液(金银花1)､聚酰胺柱洗脱浓缩液(金银花2)､醋酸乙酯萃取液及残液(金银花3)､柱色谱提取物(金银花4),分别冻干后备用｡
2.2流感病毒NA的制备
    在长满MDCK细胞的培养瓶中加入含一定流感病毒的培养上清液(含牛血清清蛋白1.2mg/mL､胰酶5μg/mL､无牛血清,其余同细胞培养液),待细胞完全病变后取上清液,1000r/min离心10min,以除去细胞碎片｡取上清液,加入NP-40(终浓度0.1%),作为原酶液｡分装,−70℃冻存备用｡
2.3热毒宁注射液及金银花提取物对流感病毒神经氨酸酶抑制作用
    取热毒宁注射液､4个金银花提取物的配制溶(反应系统中终浓度为400μg/mL)10μL,加入30μL适量稀释的NA,混匀,置室温中反应,同时设酶液对照､空白对照和扎那米韦阳性药对照(反应系统中终浓度为000.4ng/mL)｡15min后,加33mmol/LMES(pH3.5)缓冲液10μL,4mmol/L二氯化钙10μL,20μmol/L底物MUNANA10μL,水30μL,反应体系总体积为100μL,充分混匀,于37℃孵育60min,加终止液(150μL14mmol/LNaOH､83%乙醇),测定荧光强度(A)值｡设定参数:EX=360nm,EM=450nm｡计算抑制率｡如抑制率大于50%则进行复筛,分5个浓度梯度,计算样品对流感病毒NA的半数抑制浓度(IC50)｡实验重复3次。
抑制率=[(A酶-A空白)-(A实验-A空白)]/(A酶-A空白)
2.4热毒宁注射液组分对流感病毒神经氨酸酶抑制作用
    取绿原酸､断氧马钱子苷､隐绿原酸､新绿原酸､咖啡酸､栀子苷､异绿原酸A､异绿原酸B､
异绿原酸C(反应系统中检测浓度为40μg/mL)10μL,加入30μL适量稀释的NA,混匀,置室温中反应,同时设酶液对照､空白对照和扎那米韦阳性药对照(反应系统中终浓度为0.4ng/mL)｡15min后,加33mmol/LMES(pH3.5)缓冲液10μL,4mmol/L二氯化钙10μL,20μmol/L底物MUNANA10μL,水30μL,反应体系总体积为100μL,充分混匀,于37℃孵育60min,加终止液(14mmol/LNaOH150μL､83%乙醇),测定荧光强度值｡设定参数:EX=360nm,EM=450nm｡计算抑制率｡如抑制率大于50%则进行复筛,分5个浓度梯度,计算样品对流感病毒NA的半数抑制浓度(IC50)｡实验重复3次｡
3结果
3.1热毒宁注射液及金银花提取物对流感病毒神经氨酸酶抑制作用
    结果表明,热毒宁注射液､金银花水提取浓缩液(金银花1)､聚酰胺柱洗脱浓缩液(金银花2)､醋酸乙酯萃取液及残液(金银花3)､柱色谱提取物(金银花4)均有抑制H1N1､B流感病毒神经氨酸酶作用;热毒宁注射液､金银花2､金银花3､金银花4均有抑制H3N2流感病毒神经氨酸酶作用｡结果见表1~3｡
表1热毒宁注射液及金银花提取物对H1N1流感病毒神经氨酸酶抑制作用(⎯x±s,n=3)
表2热毒宁注射液及金银花提取物对H3N2流感病毒神经氨酸酶抑制作用(⎯x±s,n=3)
表3热毒宁注射液及金银花提取物对B流感病毒神经氨酸酶抑制作用(⎯x±s,n=3)
3.2热毒宁注射液组分对流感病毒NA酶抑制作用
    结果表明,绿原酸､隐绿原酸､新绿原酸､异绿原酸A､异绿原酸B､异绿原酸C均有抑制H1N1､B流感病毒神经氨酸酶作用;隐绿原酸､异绿原酸A､异绿原酸B均有抑制H3N2流感病毒神经氨酸酶作用｡结果见表4~6｡
表4热毒宁注射液组分对H1N1流感病毒神经氨酸酶抑制作用(⎯x±s,n=3)
表5热毒宁注射液组分对H3N2流感病毒神经氨酸酶抑制作用(⎯x±s,n=3)
表6热毒宁注射液组分对B流感病毒神经氨酸酶抑制作用(⎯x±s,n=3)
4讨论
    热毒宁注射液及金银花药材4个提取物对3种流感病毒神经氨酸酶的抑制活性结果表明,热毒宁注射液对H1N1､H3N2､B流感病毒神经氨酸酶活性较高,IC50分别为(46.49±2.25)､(49.77±1.77)､(45.33±5.32)μg/mL;金银花水提取浓缩液､聚酰胺柱洗脱浓缩液､醋酸乙酯萃取液及残液､柱色谱提取物对流感病毒神经氨酸酶的均有抑制作用,其中聚酰胺柱洗脱浓缩液对流感病毒神经氨酸酶的抑制活性最高,IC50分别为(15.78±0.24)､(38.27±1.07)､(14.95±3.75)μg/mL｡热毒宁注射液中9个化合物对3种流感病毒神经氨酸酶的抑制活性结果表明,绿原酸､隐绿原酸､新绿原酸､异绿原酸A､异绿原酸B､异绿原酸C对流感病毒神经氨酸酶均具有抑制作用｡
    金银花是热毒宁注射液主要组成药味之一,现代研究证明,金银花中主要含挥发油､黄酮类､有机酸､三萜类等成分,有机酸类化合物是金银花的主要有效成分,包括咖啡酸､绿原酸､新绿原酸和异绿原酸等[10],热毒宁注射液HPLC指纹图谱下有机酸主要有绿原酸､隐绿原酸､新绿原酸､咖啡酸､异绿原酸A､异绿原酸B､异绿原酸C等[11],热毒宁注射液生产工艺中采用聚酰胺柱洗脱浓缩液成分包括绿原酸､咖啡酸等有机酸类｡
    综上所述,热毒宁注射液及其有机酸类成分均有抑制流感病毒神经氨酸酶的作用｡
参考文献
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