[摘要] 目的 研究黑素對人表皮渗透屏障功能和超微结构的影响。 方法 方便选取2014年8月—2015年8月于镇江市第四人民医院皮肤科门诊招募稳定期白癜风20例，用多功能皮肤生理仪测量黑素缺失的白癜风皮损和正常皮肤的基础经皮水分丢失及恢复率；同时，从上述患者中挑选出5例，用RuO4电子特染结合透射电镜技术比较白癜风脱色皮损和正常皮肤角质层板层脂膜超微结构。 结果 白癜风组TEWL为（11.13±1.04）g/（m2·h），对侧正常皮肤组TEWL为（10.38±1.26）g/（m2·h）；两者差异无统计学意义；白癜风TEWL的恢复速率为（41.29±4.03）%，对侧正常皮肤TEWL的恢复速率为（59.47±4.23）%，白癜风皮损恢复率低于正常皮肤。电镜下观察到正常皮肤角质层细胞间隙可见4～8层排列规整电子致密带和透明带重复交替排列板层状脂膜结构，白癜风皮损角质层细胞间隙板层脂膜结构断裂出现空泡，空泡内充填有无形电子致密物。结论 黑素缺失皮损存在存在渗透屏障功能和结构的改变，可能原因皮损由于黑素缺失，影响了板层脂膜合成相关酶类活性。
[Abstract] Objective This paper tries to investigate the effects of melanin on function and ultrastructure of human epidermal osmotic barrier. Methods 20 outpatients with stable vitiligo recruited from August 2014 to August 2015 at Department of Dermatology in this hospital were convenient selected. The basal TEWL and the barrier recovery rate were measured on both vitiligo-involved and contralateral uninvolved sites by respective probes connected to a multifunctional skin physiological instrument. And 5 patients were selected among the above 20 patients， the ultrastructural changes of lipid lamellar membranes in the skin were assessed by a transmission electron microscopy （TEM） technique in combination with ruthenium tetroxide （RuO4） staining. Results TEWL in vitiligo-involved group was not significantly different compared with the uninvolved group[（11.13±1.04）g/（m2·h） vs （10.38±1.26）g/（m2·h）]）； at the same time， barrier recovery was significantly delayed in vitiligo-involved group compared with contralateral uninvolved group[（41.29±4.03）% vs （59.47±4.23）%]（P<0.05）， so the recovery rate was lower than the normal skin. Electron microscopy showed that normal skin stratum corneum cell gap can be seen 4 to 8 layers arranged regular electron dense band and zona pellucida repeated alternating plate lamellar lipid membrane structure， vitiligo skin lesions stratum corneum cell gap lamellar lipid membrane structure fragmentation， the voids are filled with invisible electronic compacts. Conclusion The loss of melanin in the skin might alter the function and the structure of epidermal permeability barrier. The reason may be absence of melanin inhibiting activity of enzymes in lamellar membrane synthesis.
[Key words] Melanin； Vitiligo； Transepidermal water loss； Ultrastructure； Lamellar membrane
皮肤的颜色深浅决定于黑色素的数量，同时发现皮肤的很多功能与黑色素相关[1]。比如深色皮肤较浅色皮肤不易感染白色念珠菌，光损伤的严重程度在深浅皮肤中有所不同，此外，在日光暴露下，浅色皮肤较深色皮肤容易干燥，深色皮肤老化较浅色皮肤推迟，然而，对于表皮渗透屏障功能，深浅色皮肤的比较目前尚不确定。临床上白癜风皮损内黑素减少甚至缺失，为我们探讨黑素、表皮屏障两者之间的关联提供了一个有价值的体内模型。该实验通过对2014年8月—2015年8月门诊招募稳定期白癜风20例渗透屏障功能进行比较研究，同时在透射电镜下对白癜风皮损和正常皮肤渗透屏障超微结构进行观察，以期探讨黑素对皮肤屏障可能影响及其机制，现报道如下。
实验一
1 资料与方法
1.1 一般资料
方便选取20例白癜风志愿者加入该实验，所有志愿者都是在鎮江市居住1年以上的常住居民。男9例，平均年龄（41.32±0.82）岁，女11例，平均年龄（26.17±1.37）岁，发病部位见表1）。以前研究紫外线影响皮肤色素，为了消除紫外线对角质层功能影响，所有患者白癜风部位及对照正常侧皮肤没有紫外线暴露，所有患者皮肤分型为Ⅲ或者Ⅳ（Fitzpatrick分型），而且患者局部和系统没有使用药物，都经过专科医生确诊，临床检查局部皮肤没有炎症，在检查前24 h内没有使用皮肤保护剂，前2 h内没有肥皂或者表面活性剂清洗。
1.2 设备和方法
多功能皮肤生理仪（MPA5）购于德国Courage Khazaka公司。采用MPA5上TM300探头测量经皮失水。采用胶带粘贴法破坏皮肤屏障，并测量0 h与5 h的经皮失水，并计算其恢复速度[（0 h经皮失水-5 h后经皮失水）/0 h经皮失水×100%=恢复率]。
1.3 统计方法
应用SPSS 13.0统计学软件分析数据，计量数据均以（x±s）表示，使用独立样本t检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 白癜风皮损和正常皮肤渗透屏障功能比较
白癜风皮肤基础经皮失水和对侧正常皮肤经皮失水：图1所示，白癜风组TEWL为（11.13±1.04）g/（m2·h），对侧正常皮肤组TEWL为（10.38±1.26）g/（m2·h）；两者差异无统计学意义（t=2.017，P>0.05）。
2.2 白癜风皮损和正常皮肤渗透屏障功能恢复能力比较
经胶盘（D-squame）破坏皮肤屏障，白癜风皮损经皮失水的恢复率和正常对侧皮肤：如图2所示，白癜风经皮失水的恢复速率为（41.29±4.03）%，对侧正常皮肤经皮失水的恢复速率为（59.47±4.23）%，白癜风皮损经皮失水的恢复速率明显地低于正常对侧皮肤 （t=4.532，P<0.02），这个实验结果表明白癜风皮损渗透屏障功能的稳态动力发生改变。
实验二
1 资料与方法
1.1 一般资料
患者选择： 5例稳定期白癜风患者（男4例，女1例），年龄23～35岁，病程1～3年。另选择5名年龄匹配健康志愿者做对照。
1.2 试剂及仪器
四氧化钌（Ruthenium tetroxide， RuO4），购自美国Polysciences公司（货号：18253）；二甲胂酸钠三水化合物（sodium cacodylate trihydrate），购自美国Sigma公司（货号：20840）
1.3 方法
1.3.1 标本准备 常规皮肤活检，皮肤组织标本立即用手术刀修剪（切除皮下组织，标本切成截面为1 mm2的小长条）。
1.3.2 板层脂膜的特染方法 标本置于2.5%戊二醛、2%多聚甲醛、0.06%氯化钙，pH 7.4的固定液中（二甲砷酸钠缓冲液配制），室温固定1 h后4℃保存。经0.1 mol/L的二甲砷酸钠缓冲液冲洗后，用0.25%的四氧化钌（ruthenium tetroxide，Ru04）在室温下暗处中固定45 min，常规方法脱水、定向包埋。60～80 nm的超薄切片经铀-铅双染色后，在HIACHIH-7000FA型电镜下观察。
2 结果
RuO4电子特染结合透射电镜技术比较观察正常人皮肤和白癜风脱色皮损表皮角质层板层脂膜超微结构健康志愿者正常皮肤经四氧化钌电子特染在角质层细胞间隙可见排列规整、电子致密带和电子透明带重复交替排列（alternating electron-dense and electron-lucent repeating pattern）的板层结构（图3）；白癜风脱色素皮损角质层板层结构断裂，空泡化，碎片化（图4）。
图3 正常皮肤角质层细胞间脂质膜结构（标尺=100 nm）
图4 白癜风皮损角质层细胞间脂质膜结构（标尺=100 nm）
四氧化钌电子特染结合透射电镜技术观察表皮角质层板层脂膜超微结构正常皮肤（图3），角质层细胞间隙可见4～8层排列规整电子致密带和透明带重复交替排列片层状脂膜结构（白箭头示）；白癜风皮损（图4），角质层细胞间隙（白箭头示）板层脂膜结构断裂出现空泡，空泡内充填有无形电子致密物（红色星号示）
3 讨论
哺乳动物的表皮是一种复层上皮（stratified epithelium），表皮的主要生理功能是渗透屏障功能（epidermal permeability barrier function），此功能通常是指表皮防止过多的水分进出机体的功能，主要在表皮的最外层角质层中进行[2]。角质层由终末分化角质形成细胞和细胞外中性脂质形成基质组成。这些脂质来源于表皮颗粒层的板层小体，这些含有板层状结构的小体，在细胞分化过程中逐渐迁移至颗粒层的上部，将其内含物分泌于角质层与颗粒层交界处，经过一系列生物化学和物理变化转化成连续的多层的板状膜样结构，又称为板层脂膜，分布于角质细胞间隙之中。这种膜状脂质和角质层细胞形成类似一种砖和灰结构，并构成渗透屏障功能的结构基础。
角质层渗透屏障功能主要通过测定基础经皮水分丢失（Transepidermal water loss ，TEWL）和表皮渗透屏障功能稳态动力学改变来衡量，TEWL越高，基础渗透屏障功能越差。表皮渗透屏障功能稳态动力学是以经皮水分丢失的恢复率来衡量。主要利用胶带破坏皮肤屏障功能，然后分别在0 h与数小时测量经皮失水分丢失，并计算其恢复率，经皮水分丢失的恢复率主要反映的是渗透屏障恢复的能力。
该实验通过测量白癜风皮损与正常皮肤的基础TEWL值，结果发现白癜风皮损和对侧正常皮肤基础TEWL差异无统计学意义（P>0.05）；使用胶带破坏皮肤屏障，分别在0 h和5 h测量两者的TEWL值，比较两者渗透屏障的恢复能力，结果发现两者差异有统计学意义（P<0.02），表明白癜风皮损渗透屏障恢复能力明显低于正常皮肤。外国研究人员[3]报导深色皮肤基础TEWL值低于浅色皮肤；Reed等[4]报导深浅色皮肤基础TEWL差异无统计学意义，但浅色皮肤角质层的紧密性低于深色皮肤。可能原因是该实验比较渗透屏障功能在相同的个体，从而减少种族、环境、个体的差异。同时，该实验通过RuO4电子特染色结合透射电镜技术观察白癜风皮损和正常皮肤角质层细胞间板层脂膜超微结构变化，结果发现正常皮肤角质层细胞间隙可见4～8层排列規整电子致密带和透明带重复交替排列片层状脂膜结构，而白癜风脱色皮损角质层间板层脂膜发生了改变，主要表现为脂质膜状结构异常，板层脂膜结构断裂，出现空泡，空泡内充填絮凝状电子致密或透明物质。
虽然白癜风渗透屏障结构和功能异常的确切机制还不清楚，但是目前认为可能与黑素密切关系。黑素合成启动所需要的黑素小体具有酸性内容物，黑素细胞分泌的黑素小体在表皮中降解可进一步酸化已高度酸化的环境。深肤色的个体表现出比浅肤色者更加酸化的角质层（SC，pH4.5～5.0 vs 5.5～6.0），高度酸化的内环境可活化或失活SC内某些酶类。首先，角质层脂质膜状结构形成过程中，所需的脂类代谢酶最适内环境pH值约为5.5，比如脑糖苷酯酶和酸性磷酸酶等，当皮肤pH值升高时，这些酶的活性则降低，影响角质层细胞间的复层板层膜结构的形成。其次，在中性和碱性条件下，皮肤蛋白激酶的活性增高[5]，后者加速降解与脂类代谢相关的酶，使其失去活性，间接地影响角质层的板层脂膜的形成。国外相关研究[6]发现，深肤色的个体表皮颗粒层板层小体的密度高于浅肤色者，深肤色者颗粒层和角质层之间有更多的脂质，这一结果表明深肤色有更多的脂质产生。另外在白癜风皮损由于黑色素缺乏，血管内皮生长因子表达减少，表皮缺乏血管内皮生长因子会延缓渗透屏障的恢复[7]。因此，白癜风皮损细胞因子的表达改变可以解释屏障功能的改变。
该实验发现虽然白癜风角质层细胞间的板层脂膜存在异常，但是基础TEWL和正常皮肤相似，可能的原因在于白癜风皮损角质层增厚[8]，通过表皮增生来代偿超微结构异常的影响。
综上所述，白癜风色素脱失皮损存在渗透屏障功能的改变，可能原因与皮损黑素缺失而影响板层脂膜合成相关的酶类有关，该研究并从超微结构水平上为黑素影响皮肤屏障提供了形态学依据，同时为白癜风患者的日常防护提供了理论基础。
[参考文献]
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[4] Reed JT， Ghadially R， Elias PM.Skin type， but neither race nor gender， influence epidermal permeability barrier function[J].Arch Dermatol，1995（131）：1134-1138.
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